嗜麥芽窄食單胞菌耐藥及傳播機(jī)制的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的：嗜麥芽窄食單胞菌（SMA）廣泛存在于自然界，在污水、自來水、土壤、人類體內(nèi)均有寄居，醫(yī)院環(huán)境如透析裝置、氧氣濕化罐、血壓計(jì)、人工呼吸裝置、通氣管道、醫(yī)務(wù)人員皮膚等也都能分離到該菌。嗜麥芽窄食單胞菌為條件致病菌，由于其致病力低，臨床上一直未引起重視。近年來，隨著廣譜抗生素和介入性診療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，該菌感染率不斷上升，已成為繼銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌之后的又一重要非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，它的臨床致病性越來越受到重視。嗜麥芽窄食單胞菌作

2、為院內(nèi)感染病原菌，在醫(yī)院環(huán)境中的傳遞模式目前尚不清楚，分子流行病學(xué)是調(diào)查菌株間流行關(guān)系的有力工具，在分子分型方法中，脈沖場凝膠電泳（PFGE）被認(rèn)為是基因分型方法中的金標(biāo)準(zhǔn)，因此應(yīng)用PFGE調(diào)查嗜麥芽窄食單胞菌分子流行病學(xué)特征，必將揭示菌株在醫(yī)院內(nèi)的傳播方式，為控制其流行和傳播提供更為有效的措施。
　　 嗜麥芽窄食單胞菌具有外膜低滲透性，抗生素難以通過細(xì)菌外膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以及泵出機(jī)制等，故對多種抗生素呈天然耐藥性。此外，該菌可產(chǎn)生

3、超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）相金屬β內(nèi)酰胺酶（MBL），故呈現(xiàn)出包括碳青霉烯類藥物在內(nèi)的多重耐藥性。臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）把復(fù)方磺胺甲噁唑作為治療嗜麥芽窄食單胞菌的首選藥，盡管復(fù)方磺胺甲噁唑體外藥敏實(shí)驗(yàn)抑菌效果敏感，但臨床應(yīng)用很快產(chǎn)生耐藥性，其他藥物如左氧氟沙星單獨(dú)應(yīng)用也易產(chǎn)生耐藥，因此推薦聯(lián)合用藥，但是關(guān)于聯(lián)合藥敏的抗菌效果體外報(bào)道不一，國內(nèi)未見喹諾酮類抗生素聯(lián)合β內(nèi)酰胺類抗生素對嗜麥芽窄食單胞菌體外聯(lián)合效應(yīng)的報(bào)道。

4、　　 近年來耐復(fù)方磺胺甲噁唑嗜麥芽窄食單胞菌的報(bào)道逐漸增多，但耐藥比率報(bào)道不一，大概在2～15％，總體上正表現(xiàn)為逐年增高的趨勢。有關(guān)嗜麥芽窄食單胞菌耐復(fù)方磺胺甲噁唑的機(jī)制國外正處于研究的熱點(diǎn)，已有研究認(rèn)為Ⅰ類整合子增強(qiáng)嗜麥芽窄食單胞菌對復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥性，整合子作為可移動(dòng)的基因，可以通過質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子傳播，成為目前細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究的熱點(diǎn)，但是國內(nèi)未見有關(guān)嗜麥芽窄食單胞菌對復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥機(jī)制的報(bào)道。整合子通過整合酶的作用可以整合

5、自然界中的耐藥基因，被整合的基因盒通過整合子廣泛傳播，成為細(xì)菌耐藥的重要機(jī)制。嗜麥芽窄食單胞菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性被認(rèn)為是固有耐藥，目前發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)耐藥基因都位于染色體上。整合子攜帶的耐氨基糖苷類基因盒已經(jīng)在沙門菌屬和假單胞菌屬中有報(bào)道，但是未見有關(guān)整合子攜帶的基因盒導(dǎo)致嗜麥芽窄食單胞菌耐氨基苷類的報(bào)道。
　　 嗜麥芽窄食單胞菌作為一種重要的醫(yī)院內(nèi)病原菌，消毒和滅菌是控制其引起醫(yī)院感染的重要手段。隨著消毒劑的廣泛使用，由于細(xì)

6、菌長期暴露于濃度日漸增高的消毒劑環(huán)境中，逐漸產(chǎn)生染色體或質(zhì)粒的變異，所獲得遺傳物質(zhì)編碼的耐藥性可得以穩(wěn)定遺傳，從而引發(fā)嚴(yán)重的臨床感染。細(xì)菌對消毒劑的抗性機(jī)制研究不多，抗性機(jī)制尚不清楚。
　　 因此本研究旨在通過分子流行病學(xué)的手段，揭示菌株在醫(yī)院內(nèi)的傳播方式；探討嗜麥芽窄食單胞菌對復(fù)方磺胺甲噁唑和氨基糖苷類抗生素的耐藥機(jī)制，明確整合子在嗜麥芽窄食單胞菌耐藥性傳播中的重要地位；探討嗜麥芽窄食單胞菌對消毒劑的耐藥機(jī)制及傳播機(jī)制；并通過

7、聯(lián)合藥敏的手段旨在探索新的治療方案，為控制嗜麥芽窄食單胞菌在醫(yī)院內(nèi)的出現(xiàn)和傳播提供充分有力的理論依據(jù)。
　　 方法：采用病例回顧的方法分析了2004～2007年臨床分離的165株株嗜麥芽窄食單胞菌的臨床相關(guān)資料，探討臨床感染的相關(guān)危險(xiǎn)因素。
　　 采用脈沖場凝膠電泳技術(shù)對18株連續(xù)臨床分離株和8株耐消毒劑的菌株的染色體進(jìn)行基因分型，并應(yīng)用quantity one軟件分析同源性，條帶相關(guān)性90％以上的被認(rèn)為同一基因亞型。<

8、br>　　 采用微量肉湯稀釋法檢測8種抗生素對165株嗜麥芽窄食單胞菌的最小抑菌濃度；采用棋盤格稀釋法，分別測定頭孢他啶與左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦與左氧氟沙星聯(lián)合應(yīng)用時(shí)最小抑菌濃度（MIC），并根據(jù)公式計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FIC），根據(jù)FIC指數(shù)判斷是否有協(xié)同效應(yīng)。
　　 應(yīng)用基因擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增sul1，int1，aac（6'）-Ⅰ，aac（6'）-Ⅱ，ant（2"）-Ⅰ等基因。擴(kuò)增陽性產(chǎn)物測序并與GenBank比對。堿裂

9、解法提取質(zhì)粒后作為模板，基因擴(kuò)增。
　　 采用濾膜結(jié)合法質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)探討耐消毒劑基因的轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　 結(jié)果：嗜麥芽窄食單胞菌醫(yī)院感染以肺部感染為主，占全部病例的87.9％。患者使用呼吸機(jī)、泌尿道插管、動(dòng)靜脈插管等比率為61.8％；合并感染菌以銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、念珠菌為主；有124例患者合并其他部位醫(yī)院感染，占總感染例數(shù)的75.2％。選擇2007.4至2007.7收集的18株臨床連續(xù)分離的嗜

10、麥芽窄食單胞菌進(jìn)行基因同源性，共得到了17個(gè)基因型，采用quantity one軟件分析基因同源性，結(jié)果表明條帶4和5有100％的同源性，條帶2和9有95％的同源性，追蹤臨床資料表明4和5同在RICU，而2和9的患者分別來自EICU和RICU，結(jié)果說明在RICU病房有同一克隆株的傳播，在RICU和EICU不同病房也有同一克隆株的傳播。
　　 左氧氟沙星與頭孢他啶聯(lián)合應(yīng)用，F(xiàn)IC范圍主要在0～1以協(xié)同和相加為主，無拮抗作用，F(xiàn)IC

11、在0.5以下比例占56.7％，以協(xié)同為主；左氧氟沙星與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用，F(xiàn)IC范圍主要在0～1以協(xié)同和相加為主，無拮抗作用，F(xiàn)IC在0.5～1之間的比例為占53.3％，以相加為主。
　　 應(yīng)用肉湯稀釋法共檢測13株菌耐復(fù)方磺胺甲噁唑，通過E-test方法進(jìn)一步確證共有12株耐藥，耐藥率為7.8％。12株耐藥的菌株中，sul1基因陽性8株，占66.7％，而48株敏感的菌株中，sul1基因均陰性；Ⅰ整合子的陽性株為8株，陽性

12、率為13.3％。
　　 60株嗜麥芽窄食單胞菌中擴(kuò)增aac基因，aac（6'）-Ⅱ基因陽性4株，陽性率為6.7％，ant（2"）-Ⅰ基因陽性3株，陽性率為5％，aac（6'）-Ⅰ基因陽性2株，陽性率為3.3％。對aac（6'）-Ⅱ基因陽性4株，應(yīng)用intl的上游引物與aac（6'）-Ⅱ的下游引物為擴(kuò)增引物，結(jié)果2株在1000bp有陽性產(chǎn)物，2株菌在500bp有陽性產(chǎn)物；產(chǎn)物測序后證明aac（6）-Ⅱ位于Ⅰ類整合子上。為了明確氨基

13、糖苷類修飾酶基因的位置，進(jìn)一步了解其傳播機(jī)制，提取質(zhì)粒后，擴(kuò)增以上陽性基因，結(jié)果所有基因都陽性，說明耐氨基糖苷類基因存在于質(zhì)粒上。
　　 60株嗜麥芽窄食單胞菌中qacE△1基因擴(kuò)增結(jié)果，有8株陽性，陽性率13.3％。8株qacE△1基因陽性的菌株質(zhì)粒接合試驗(yàn)成功3例。對8株菌進(jìn)行基因同源性分析，共有6個(gè)基因型的分布，采用quantity one軟件分析同源性，表明條帶1和條帶5有93％的同源性，條帶3和條帶8有90％的同源性，

14、追蹤臨床資料表明病例1和5同在呼吸科，而3和8的患者也來自呼吸科，但是分別位于呼吸科普通病房和RICU，結(jié)果說明在呼吸ICU病房和普通病房有相似克隆株的傳播。
　　 結(jié)論：
　　 1.嗜麥芽窄食單胞菌引起的感染以肺部感染為主，與感染有關(guān)的因素包括年齡、基礎(chǔ)疾病、住院時(shí)間、侵入性治療設(shè)施的應(yīng)用等，同一克隆株的出現(xiàn)說明此菌有在醫(yī)院內(nèi)有引起流行的趨勢。
　　 2.左氧氟沙星與β內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合主要以協(xié)同或相加為主，抗生