嗜麥芽窄食單胞菌敏感株的適應性耐藥及其初步機制.pdf

1、近年來，隨著廣譜抗生素的大量使用，致病力原本不強的條件致病菌嗜麥芽窄食單胞菌已然成為醫(yī)院感染的重要病原菌，致使感染率不斷上升，導致免疫力低下或長期大量使用廣譜抗生素的人群呼吸道感染、心內(nèi)膜炎及敗血癥等危及生命的嚴重感染。體外藥敏試驗結果證實，嗜麥芽窄食單胞菌對磺胺類、β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類等幾乎所有抗生素均可產(chǎn)生耐藥性。因此，目前國內(nèi)尚無學者對嗜麥芽窄食單胞菌的感染提出統(tǒng)一的治療方案，一些學者的推薦方案僅基于回顧性研究和病例報

2、告，但嗜麥芽窄食單胞菌耐藥突變快速，因此其實用價值有限。國外學者推薦的治療方案也常有悖于藥敏試驗結果和臨床治療結果，故對于該菌的治療，國內(nèi)外一致提倡根據(jù)藥敏結果選擇敏感抗生素進行治療。 但臨床實踐證明，即使根據(jù)藥敏結果選用抗生素，甚至聯(lián)合幾個同時敏感的抗生素進行治療也不能使感染完全得到控制，這就是臨床上治療該菌時常見的體外藥敏試驗結果與臨床治療結果不一致的現(xiàn)象，導致大量患者因不能有效控制感染而死亡。但對于這類常見現(xiàn)象，國內(nèi)學者長

3、期以來不予重視，只是認為由于該菌生長緩慢而突變迅速造成了該結局，并未對其進行深入研究。試驗證明，該菌生長并不緩慢而是生長很快，并且如果發(fā)生了耐藥遺傳物質突變應該能從基因水平得以證實，但至今未見到該菌由于基因突變致使體外敏感性與臨床療效不一致的報道。 國外學者對其他革蘭陰性菌研究時發(fā)現(xiàn)，不同類型的多種抗生素皆可誘導敏感菌產(chǎn)生暫時性耐藥，本文按國外慣用定義稱為適應性耐藥。這種耐藥形式可導致細菌耐藥表型暫時轉變，并認為這種耐藥性使敏感

4、菌療效不佳，即適應性耐藥引起敏感菌治療效果低下，但該現(xiàn)象一直未得到重視。這種耐藥性和有耐藥遺傳物質介導的耐藥性不同，它不涉及基因組突變，因此臨床微生物實驗室不能檢測出來，更不知其發(fā)生規(guī)律，無法報告臨床。在特定條件下，敏感的嗜麥芽窄食單胞菌能否產(chǎn)生適應性耐藥，這種耐藥有無規(guī)律，其發(fā)生機制是什么，闡明這些，可為臨床治療嗜麥芽窄食單胞菌敏感株作出提示，避免適應性耐藥發(fā)生。 嗜麥芽窄食單胞菌中Ⅰ型整合子介導的復方新諾明耐藥基因的發(fā)現(xiàn)，將

5、導致該抗生素耐藥傳播迅速，其應用會受到限制。喹諾酮類治療嗜麥芽窄食單胞菌時易誘發(fā)敏感株突變，造成多種抗生素耐藥致使治療失敗。可見，該菌本身耐藥變遷快速，耐藥機制復雜，不同醫(yī)療機構根據(jù)當?shù)啬退幈O(jiān)測結果選擇符合當?shù)啬退幪攸c的抗生素進行治療，所以各地治療方案不盡相同。而對于由該菌引起的危及生命的嚴重感染，除了采用國外推薦的復方新諾明和喹諾酮類治療外，仍有很多地方根據(jù)藥敏報告采用阿米卡星或慶大霉素聯(lián)合其他抗生素進行治療。鑒于上述原因以及中國藥品

6、管理局規(guī)定和參照美國臨床實驗室標準化委員會常規(guī)藥敏實驗報告時假單胞菌的選藥指南，本文選用對慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星和復方新諾明皆敏感的嗜麥芽窄食單胞菌，對其誘導處理后，再檢測其能否對原本敏感的上述四種抗生素產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生規(guī)律及初步探討其耐藥機制。 目的： （1）篩選出左氧氟沙星，復方新諾明，慶大霉素和阿米卡星表型敏感且不含抗慶大霉素和阿米卡星修飾酶基因的敏感菌作為受試菌。 （2）分別測定受試菌對慶大霉素、

7、阿米卡星、復方新諾明和左氧氟沙星的最低抑菌濃度值（MIC）和最低殺菌濃度值（MBC）。 （3）誘導受試菌適應性耐藥，檢測處于適應性耐藥期細菌的廣譜耐藥性。 （4）測定不同耐藥時期菌體內(nèi)抗生素含量。 （5）測定不同耐藥時期菌體外膜蛋白構成，對有差異的蛋白進行序列測定，確定有差異的蛋白類型。 方法： （1）用K-B法對收集到的88株嗜麥芽窄食單胞菌臨床分離株做藥敏試驗，篩選出對慶大霉素、阿米卡星、復方

8、新諾明和左氧氟沙星敏感株。再用7對抗慶大霉素和阿米卡星的修飾酶基因引物對全部株進行擴增，收集不含任何一種氨基糖苷修飾酶基因且4種抗生素全為敏感的菌株作為受試菌。用液體稀釋法測定受試菌對上述4種抗生素的MIC值和MBC值； （2）將受試菌因為處理方法不同分為試驗組和對照組，對照組只是在誘導階段不加抗生素誘導即空白誘導，其余處理與試驗組完全相同。以1×MIC慶大霉素/阿米卡星分別誘導試驗組細菌1h，再以4×MIC濃度的慶大霉素鄺可米

9、卡星殺菌1h，計算殺菌速度，比較試驗組平均殺菌速度和對照組平均殺菌速度大小。若抗生素對試驗組的殺菌速度小于對對照組的殺菌速度表示誘導使細菌產(chǎn)生了耐藥性；如果兩組殺菌速度相同則誘導不產(chǎn)生耐藥性；如果對試驗組殺菌速度大于對照組殺菌速度表示誘導使試驗組細菌產(chǎn)生了敏感性。以阿米卡星誘導細菌后，再分別用復方新諾明／左氧氟沙星進行殺菌，證實誘導菌能否使復方新諾明／左氧氟沙星敏感性降低。 （3）鑒于測定抗生素含量費用昂貴，故本試驗只檢測01號

10、菌誘導后第2、4、6、8、10h吸收慶大霉素和阿米卡星的量來評價誘導后不同時段（第2、4、6、8、10h）抗生素進入菌體的情況。具體操作如下：一邊做誘導試驗（誘導試驗同前），一邊同步收集誘導后第2、4、6、8和10h并加入了抗生素至終濃度為10μg/ml，且殺菌1h的細菌。當誘導試驗結果證明誘導耐藥成功后，所收集的細菌方能用于測定抗生素含量。離心去除培養(yǎng)上清，PBS（pH7.0）洗滌沉淀2次，去除PBS后再加新的PBS混勻細菌懸液，超聲

11、破菌。取超聲后的菌液一滴涂片染色，鏡下確定全部菌體都破裂。離心收集上清，上清液中的抗生素含量就是不同耐藥時期的細菌吸收至體內(nèi)的抗生素。采用高效液相色譜法測定此液體中的抗生素含量； （4）Carlone法提取受試菌誘導后第1h～第10h的外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析OMP的構成成分；對有變化的外膜蛋白溶液送交蛋白測序公司進行氨基酸序列測定，測序結果在G

12、eneBank中進行序列同源性比對，確定所測外膜蛋白的種類。 結果： （1）K-B法和PCR法篩選出符合條件的受試菌3株，分別命名為01、02、03號菌株。01、02、03號菌對各抗生素的最低抑菌濃度（MIC）值（μg/ml）和最低殺菌濃度（MBC）值（μg／ml）分別如下：慶大霉素的MIC值分別是0.5、1、0.5；慶大霉素的MBC值分別是1.5、2.5、1.5；阿米卡星的MIC值分別是0.25、0.5、0.5；阿米卡

13、星的MBC值分別是0.5、1.5、1；復方新諾明的MIC值分別是0.25、0.25、0.25；復方新諾明的MBC值分別是0.5、0.5、0.5；左氧氟沙星的MIC值分別是0.25、0.25、0.5；左氧氟沙星的MIC值分別是0.5、0.5、1； （2）誘導后試驗組細菌對4種抗生素均產(chǎn)生耐藥性，即從誘導后第4h～第8h抗生素殺菌能力減弱甚至失去殺菌力即產(chǎn)生了適應性耐藥。從誘導后第9h以后，抗生素開始逐漸恢復殺菌能力即細菌逐漸失去耐

14、藥性又變?yōu)槊舾芯?。對照組細菌沒有這種規(guī)律性變化； （3）01號菌試驗組細菌在誘導后第2、4、6、8和10小時的慶大霉素含量（μg／ml）情況分別是：1.69、0.81、0.32、0.71和1.57；對照組細菌誘導后第2、4、6、8和10小時的慶大霉素含量（μg/ml）情況分別是：1.71、1.76、1.69、1.73和1.8。01號菌試驗組細菌在誘導后第2，4，6，8和10小時的阿米卡星含量（μg／ml）情況分別是：1.56、0

15、.66、0.29、0.59和1.37；對照組細菌誘導后第2、4、6、8和10小時的阿米卡星含量（μg／ml）情況分別是：1.73、1.75、1.69、1.74和1.79。 （4）收集誘導后不同時段的細菌，分別提取其外膜蛋白（outer membraneprotein，OMP），SDS-PAGE電泳顯示耐藥高峰期試驗菌在45kD處及60kD的OMP表達幾乎消失；對45kD處及60kD的OMP進行氨基酸序列測定，測定序列與美國國家生

16、物信息中心的蛋白序列進行比對。結果顯示，45kD處的蛋白與提交到生物信息中心的該菌的氨基酸運輸跨膜蛋白完全同源（amino-acid transporter transmembrane protein），全長475aa；60kD處的外膜蛋白測序結果與生物信息中心報道的該菌外膜上的轉運蛋白（putative transfer protein）完全同源，全長823aa。 結論： （1）慶大霉素和阿米卡星能誘導嗜麥芽窄食單胞菌

17、產(chǎn)生適應性耐藥，試驗用的4種抗生素皆對適應性耐藥期細菌的殺菌能力減弱。由于受試菌沒有耐藥基因，可見沒有耐藥基因的變化，耐藥表型也能發(fā)生變化，即嗜麥芽窄食單胞菌中，耐藥不完全由耐藥基因決定； （2）該菌中，某些耐藥表型是動態(tài)變化著的，其轉變有時限性，即經(jīng)過一定時間之后，其表型又可回復到始發(fā)狀態(tài)，揭示了該菌耐藥的復雜性和傳統(tǒng)耐藥性檢測的粗糙； （3）誘導后細菌吸收抗生素的變化步調與細菌發(fā)生適應性耐藥步調基本一致，提示耐藥表型