Aroclor1254通過p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)連接蛋白周轉(zhuǎn)影響血睪屏障功能.pdf

1、目的:多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyl，PCB)作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的典型代表，是一類廣泛應用到日常生活中的持久性環(huán)境有機污染物。能通過空氣、水-、食物等多種途徑侵入人體，給人類健康造成危害，由該類有機污染物帶來的健康危害已引起了世界各國學者的廣泛關注。近年來，在PCB的毒性效應研究中，其對生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的損害日益受到重視，并且尤以其對男性生殖功能的影響為焦點。現(xiàn)已有文獻報道，PCB暴露可能導致

2、睪丸重量和精子數(shù)量減少，在人類流行病學研究中也發(fā)現(xiàn)樣本血清中的PCBs含量和睪酮水平之間呈現(xiàn)負相關。然而，PCBs影響精子發(fā)生的具體作用機制目前還未被完全闡明。
　　血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)位于曲細精管和毛細血管之間，是生精上皮中以Sertoli細胞(Sertoli cell，SC)間的緊密連接為基礎形成的結(jié)構。該結(jié)構是既作為一道有效的免疫屏障，使各期精細胞的發(fā)育在相對獨立的小室內(nèi)進行，避免精子

3、抗體的產(chǎn)生，還避免了血液循環(huán)中的有害物質(zhì)對生精過程產(chǎn)生影響，保障了精子發(fā)生的順利進行。因此，該結(jié)構對雄性生殖功能具有重要的意義。
　　圍繞上述問題，本課題選取PCB混合物Aroclor1254對雄性SD成年大鼠及體外原代培養(yǎng)的Sertoli細胞進行染毒，評估BTB結(jié)構及其功能的變化。通過分析BTB相關連接蛋白的表達及定位的改變，尋找Aroclor1254毒性作用的靶分子，從而揭示該化合物對BTB結(jié)構及其功能影響的分子機制，期待為有

4、機環(huán)境污染物的生殖毒理學研究和該類化合物對人類生殖風險的評估以及不孕不育的預防提供實驗依據(jù)。
　　研究方法:1.本研究體內(nèi)實驗選取成年90d雄性SD大鼠(250-300 g)為研究對象，腹腔注射Aroclor1254（1、3 mg/kg）或Aroclor1254(3 mg/kg)與p38 MAPK抑制劑SB203580(10μM)的混合物后，進行:①生物素標記的體內(nèi)BTB屏障功能檢測;②制備睪丸組織冰凍切片，免疫熒光觀察BTB相關

5、連接蛋白分布的變化;③免疫印跡檢測BTB相關連接蛋白水平。2.體外實驗原代培養(yǎng)20d雄性SD大鼠Sertoli細胞，培養(yǎng)后第3d用Aroclor1254(0-100μg/ml)處理，于不同時間點:①測定細胞活力篩選最佳染毒濃度;②測定跨內(nèi)皮電阻(TER)值及熒光素鈉(Na-F)滲透率反映Sertoli細胞屏障功能;③免疫印跡檢測Sertoli細胞連接蛋白水平;④免疫熒光觀察Sertoli細胞連接蛋白分布;3.Caveolin依賴的胞內(nèi)轉(zhuǎn)

6、運抑制劑膽固醇氧化酶(CO)與Aroclor1254聯(lián)合處理Sertoli細胞后，檢測以上體外指標變化(②-④)。4.泛素蛋白連接酶Itch siRNA沉默與Aroclor1254聯(lián)合處理Sertoli細胞后，檢測以上體外指標變化(②-④)。
　　結(jié)果:1.Aroclor1254通過p38 MAPK途徑破壞大鼠體內(nèi)BTB屏障功能。體內(nèi)BTB功能檢測實驗觀察到Aroclor1254處理后生物素自生精小管基底膜向管腔的彌散距離與對照組

7、相比明顯增大，而在Arclor1254+SB203580處理組，該彌散距離與Arclor1254組相比顯著降低;免疫熒光檢測結(jié)果顯示，Aroclor1254處理后BTB相關連接蛋白occludin的熒光信號與對照組相比減弱，JAM-A、N-cadherin信號分散不集中，而Arclor1254+SB203580組不存在該現(xiàn)象;免疫印跡結(jié)果顯示，Aroclor1254處理組occludin表達量與對照組相比顯著降低同時p38 MAPK磷酸

8、化增多，其他連接蛋白表達水平無顯著變化，Arclor1254+SB203580組occludin表達量無明顯改變。2.Aroclor1254通過p38 MAPK途徑影響體外Sertoli細胞上皮屏障功能。細胞活力實驗結(jié)果顯示，Aroclor1254在10μg/ml濃度下對Sertoli細胞無顯著毒性作用，即對其存活率無明顯影響;TER及Na-F滲透率測定結(jié)果顯示，Aroclor1254處理后SC屏障功能顯著下降;免疫印跡發(fā)現(xiàn)Arolco

9、r1254處理后occludin水平降低，p38磷酸化水平升高，同時胞內(nèi)轉(zhuǎn)運功能蛋白caveolin-1的水平增高;免疫熒光實驗觀察到與對照組相比，Aroclor1254處理組BTB連接蛋白occludin信號減弱，N-cadherin、β-catenin信號分散不集中于細胞連接處。Aroclor1254+SB253580組與對照組相比無以上變化，即SB253580可以拮抗Aroclor1254對BTB的影響。3.Aroclor1254

10、-p38MAPK通過Caveolae依賴的連接蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運影響體外BTB屏障功能。TER及Na-F滲透率測定結(jié)果顯示，CO處理可部分拮抗Aroclor1254引起的體外屏障功能下降;免疫印跡結(jié)果顯示CO處理對Aroclor1254引起的occludin水平降低無影響;免疫熒光可見CO處理后Aroclor1254不能引起N-cadherin、β-catenin的定位變化。4.Aroclor1254-p38 MAPK通過泛素連接酶Itch下

11、調(diào)occludin蛋白水平影響體外BTB屏障功能。免疫印跡顯示Itch沉默后，Aroclor1254不能引起occludin水平降低;TER及Na-F滲透率測定結(jié)果顯示，Itch沉默可部分拮抗Aroclor1254引起的體外屏障功能下降;免疫熒光可見Itch沉默后Aroclor1254不能引起occludin的定位變化。
　　結(jié)論:Aroclor1254通過p38 MAPK途徑促進caveolae依賴的連接蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及Itch介