基因I型戊型肝炎病毒ORF3抑制TNF-α誘導(dǎo)的核因子-κB信號(hào)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　由于人們?cè)?0世紀(jì)80年代之前尚沒有認(rèn)識(shí)到戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）的存在，故HEV被眾多學(xué)者稱為“被遺忘的病毒”。直到上世紀(jì)80年代，在蘇聯(lián)占領(lǐng)的阿富汗軍營(yíng)中爆發(fā)了一種不明原因的肝炎，后來(lái)研究人員利用電鏡在志愿者的大便中發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒，經(jīng)基因測(cè)序，于1991年正式命名為HEV。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)手段的不斷提高以及人們對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷深入，HEV所引起的公共衛(wèi)生問(wèn)題也逐漸成為科學(xué)界關(guān)

2、注的焦點(diǎn)。先前認(rèn)為，HEV感染主要發(fā)生于基礎(chǔ)衛(wèi)生設(shè)施條件較差的發(fā)展中國(guó)家，但近年來(lái)，在歐美、日本等一些發(fā)達(dá)國(guó)家也出現(xiàn)了一些非輸入性本土化的HEV感染病例。目前，HEV感染呈全球分布，全世界每年約20億人感染HEV，約1400萬(wàn)人為有癥狀者，每年約30萬(wàn)人死于HEV感染，HEV感染占急性肝炎的50％以上，已成為全球急性病毒性肝炎的首要病因。自2012年開始至今，HEV在我國(guó)的感染及死亡總?cè)藬?shù)每年均超過(guò)甲型肝炎病毒（hepatitis A

3、virus,HAV）。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，HEV感染后為一自限性過(guò)程，但在普通人群中仍有1-2%的患者發(fā)展為重型肝炎而導(dǎo)致死亡，孕婦感染HEV后可導(dǎo)致高達(dá)26.9%的死亡率，近年來(lái)在器官移植、腫瘤放化療及HIV感染者等一些免疫功能受到抑制的人群中出現(xiàn)了為數(shù)不少的慢性化病例的報(bào)道。因此，戊肝的防控形勢(shì)不容樂觀。盡管我國(guó)在2012年上市了全球第一支HEV疫苗，但HEV致病的確切機(jī)制并未得以詳細(xì)的闡明。
　　HEV是一單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)

4、約7.2kb，有3個(gè)開放讀碼框（ORF），4個(gè)基因型，1個(gè)血清型。其中，基因I型和II型主要感染人類，而III型和IV型為人畜共患性疾??；我國(guó)主要流行基因I型和IV型。研究發(fā)現(xiàn)，基因I型HEV感染后相較其它基因型HEV感染具有更高的病毒血癥和更嚴(yán)重的病情，但機(jī)制不明。由于缺乏成熟的小動(dòng)物研究模型和體外細(xì)胞模型，目前對(duì)HEV致病機(jī)制的研究大多集中于對(duì)其基因組功能的分析上。HEV的ORF1和ORF2分別編碼HEV的非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白，OR

5、F3片段具體的功能目前尚沒有一致意見。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HEV ORF3蛋白抑制TNF-α誘導(dǎo)的p65入核，我們推測(cè)，ORF3蛋白可能通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB）信號(hào)為HEV復(fù)制優(yōu)化環(huán)境。本研究通過(guò)構(gòu)建HEV ORF3蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，以人肺腺癌A549上皮細(xì)胞（A549）為載體，檢測(cè)HEV ORF3對(duì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)的影響,從細(xì)胞水平進(jìn)一步探討HEV OR

6、F3蛋白在TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)調(diào)節(jié)中的具體作用及機(jī)制，初步揭示HEV感染后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)異常與HEV致病的相關(guān)性，為闡明HEV的致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　在前期研究工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討基因I型戊型肝炎病毒ORF3蛋白在TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及調(diào)控機(jī)制，闡明基因I型HEV導(dǎo)致較高病毒血癥及較嚴(yán)重病程的具體機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的巴基斯坦株Sar-55

7、（基因I型HEV）的cDNA序列中ORF3片段的序列，分別設(shè)計(jì)其上下游引物，采用PCR方法擴(kuò)增出HEV ORF3片段，利用限制性內(nèi)切酶將ORF3片段連接在真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，構(gòu)建帶有綠色熒光的ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒（ORF3-GFP），基因測(cè)序及酶切鑒定正確；
　　2.將鑒定正確的ORF3-GFP融合蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，48小時(shí)后，以TNF-α（50ng/ml）誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)活化，通過(guò)蛋白印跡技術(shù)（Wester

8、n blot）分別檢測(cè)細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)p65的表達(dá)水平，通過(guò)凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性，分別以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time PCR）和酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）檢測(cè)NF-κB下游分子的變化情況；
　　3.用Western blot檢測(cè)NF-κB經(jīng)典信號(hào)通路途徑中IKKβ的活性變化及IKBα的磷酸化水平的變化；以基因芯片技術(shù)（PCR Array）初步篩選ORF3-GFP作用于NF-κB信號(hào)通

9、路中的關(guān)鍵分子，并以real time PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證；
　　4.設(shè)計(jì)并合成上述PCR Array中發(fā)現(xiàn)的負(fù)性調(diào)控基因的三條特異的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），進(jìn)行干擾效果的初步評(píng)估，采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)干擾上述初篩的主要調(diào)控基因后，以熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性

10、的變化；
　　5.通過(guò)Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和非折疊蛋白反應(yīng)的標(biāo)志蛋白，觀察A20分子表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)性；給予非折疊蛋白反應(yīng)的阻滯劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后轉(zhuǎn)染ORF3-GFP，給予TNF-α干預(yù)，以熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)NF-κB活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.成功構(gòu)建了基因I型HEV ORF3表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，48小時(shí)后，熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光表達(dá)，以HEV ORF3單克隆抗

11、體行Western blot檢測(cè)，驗(yàn)證了ORF3蛋白在A549細(xì)胞中成功表達(dá)，將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序及酶切鑒定正確；
　　2.Western blot顯示，在沒有TNF-α刺激時(shí)，p65主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，給予TNF-α刺激后，空白組及轉(zhuǎn)染空載體的A549細(xì)胞，p65出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)染了ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞，給予TNF-α刺激后，細(xì)胞核內(nèi)p65的數(shù)量極少；
　　3.EMSA實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染GFP的細(xì)胞和未處理的細(xì)胞

12、給予TNF-α刺激后，與陽(yáng)性對(duì)照組一樣，出現(xiàn)了蛋白-DNA復(fù)合物，而表達(dá)ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞組即使給予TNF-α刺激，也未見蛋白-DNA復(fù)合物的出現(xiàn)，蛋白-DNA復(fù)合物在冷競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)時(shí)消失，而進(jìn)行突變競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，該復(fù)合物再次出現(xiàn)；
　　4.Real time PCR示ORF3-GFP明顯抑制了TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的下游基因IL-1β、COX2和ICAM1的mRNA表達(dá)水平;ELISA證實(shí)NF-κB的下游分子IL-1β、C

13、OX2、和ICAM1的蛋白水平也同樣受到了抑制；
　　5.Western blot顯示，空白細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞組給予TNF-α刺激后，IKKβ活性和IKBα的磷酸化水平明顯增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞給予TNF-α刺激后，IKKβ活性和IKBα的磷酸化水平明顯受到抑制；
　　6.PCR Array實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞A20基因水平明顯高于對(duì)照組10倍以上，real time PCR和wes

14、tern blot也證實(shí)了同樣的結(jié)果；
　　7.將A20基因進(jìn)行RNAi后，ORF3-GFP蛋白抑制NF-κB活性的現(xiàn)象得到了逆轉(zhuǎn)；表達(dá)ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞組A20的升高與GRP78呈正相關(guān)性，將非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）抑制后，ORF3-GFP抑制TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB活性的現(xiàn)象也得到了逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論
　　1.基因I型HEV ORF3蛋白抑制TNF-α誘導(dǎo)

15、的NF-κB活性及其下游分子，提示這可能是基因I型HEV在體內(nèi)持續(xù)存在并引起較高病毒血癥和更長(zhǎng)病程的原因；
　　2.基因I型HEV ORF3蛋白在早期可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR激活NF-κB信號(hào)，隨后，NF-κB下游的靶基因A20在NF-κB信號(hào)中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，及時(shí)終止NF-κB信號(hào)的無(wú)限放大。這提示，ORF3蛋白在不同的階段對(duì)NF-κB信號(hào)的調(diào)控可能存在雙向調(diào)節(jié)作用。
　　3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NF-κB信號(hào)之間有著密切聯(lián)系