人表皮細胞對胰酶耐受及黑素小體轉運的相關研究.pdf

1、目的：觀察人表皮細胞對胰酶消化的耐受能力，探索分離和純化表皮細胞的新方法，探討胰酶耐受細胞的干性表達。并在原代細胞培養(yǎng)的基礎上，探索角質形成細胞(Keratinocyte,KC)對黑素小體(Melanosome,MS)的吞噬，同時驗證煙酰胺對吞噬的抑制作用。
　　方法：
　　(1)中性蛋白酶及胰酶消化獲取表皮細胞，用0.25％的胰酶懸浮表皮細胞，以3.0×105/ml的細胞密度種植于12孔板，每間隔半小時或1小時終止胰酶1孔

2、，其中胰酶作用時間最長達46小時，同樣地胰酶處理培養(yǎng)過的表皮細胞，記錄不同細胞貼壁時間、生長狀態(tài)，并在接種后第7天，對貼壁細胞進行Nestin、Sox10抗體免疫細胞化學染色。
　　(2)從人毛發(fā)中提取的黑素小體經(jīng)透射電鏡檢測后，加到人原代角質形成細胞中，觀察黑素小體是否被吞噬，用HMB-45抗體免疫細胞化學染色檢測。同時利用Millicell建立了黑素細胞(Melanocyte,MC)和角質形成細胞共培養(yǎng)模型，用HMB-45熒光

3、抗體標記角質形成細胞吞噬的黑素小體，并分別加煙酰胺進行干預。
　　結果：
　　(1)隨著胰酶作用時間的延長，貼壁細胞數(shù)目遞減，細胞貼壁所用時間也延長。所有孔中最早出現(xiàn)的貼壁細胞為樹突狀細胞，這些細胞開始生長緩慢，大約4天后生長迅速，10天后部分孔出現(xiàn)魚群樣細胞團。培養(yǎng)過的表皮細胞胰酶消化后結果和原代細胞類似，但不出現(xiàn)細胞團。部分孔經(jīng) Nestin、SOX10抗體的免疫細胞化學染色結果均為陽性，其中以Nestin抗體較明顯。<

4、br>　　(2)角質形成細胞能吞噬從人毛發(fā)中提取的黑素小體，在共培養(yǎng)模型中，黑素細胞產(chǎn)生的黑素小體可以通過孔徑為8微米的孔膜，并被其下的角質形成細胞所吞噬，兩者均驗證了煙酰胺抑制吞噬作用。
　　結論：
　　(1)人表皮細胞對胰酶消化的耐受能達46小時，中和后，黑素細胞貼壁早于角質形成細胞，貼壁后大多數(shù)細胞增殖力強，干細胞表面標記顯示陽性。
　　(2)角質形成細胞可以吞噬從毛發(fā)中提取的黑素小體，Millicell共培養(yǎng)模