丹皮酚抑制黑素合成相關(guān)分子機(jī)制的研究及KC-MC共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子對(duì)黑素合成的反饋調(diào)節(jié).pdf

1、㈠本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體丹皮酚具有較強(qiáng)的抑制黑素合成的活性。本文研究了丹皮酚對(duì)黑素合成限速酶-Tyr的活性、mRNA和蛋白表達(dá)的影響，及對(duì)Tyr啟動(dòng)子配體小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(MITF)和MITF啟動(dòng)子配體cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化表達(dá)的影響。本研究首次表明，丹皮酚可以通過抑制CREB的磷酸化，使其不活化，抑制MITF的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)Tyr的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)，最終影響黑素合成。本研究結(jié)果有助于理解丹皮酚抗黑素合成的作用

2、機(jī)制，有利于研究和篩選抗黑素沉著異常的藥物。 ㈡我們研究了丹皮酚抑制黑素合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以進(jìn)一步探討丹皮酚美白功效的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，JNK1/2/3特異性抑制劑SP600125能夠拮抗丹皮酚對(duì)黑素合成的抑制作用，包括黑素含量、Tyr活性及其mRNA和蛋白表達(dá)等多個(gè)指標(biāo)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)丹皮酚能夠上調(diào)磷酸化JNK/SAPK的表達(dá)，而對(duì)磷酸化ERK和p38MAPK均無影響。表明在B16F10細(xì)胞內(nèi)，丹皮酚可以激活MAPK家族的J

3、NK/SAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而減少黑素合成。而該家族的ERK1/2以及p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑未參與介導(dǎo)丹皮酚的作用。根據(jù)上述結(jié)果，我們推測(cè)丹皮酚的作用機(jī)制是：丹皮酚激活了JNK/SAPK激酶，活化了JNK/SAPK途徑，該途徑的活化直接或間接激活了某種磷酸化酶，從而使磷酸化的CREB去磷酸化，下調(diào)MITF表達(dá)，進(jìn)而減少Tyr表達(dá)，抑制黑素合成。在B16F10小鼠黑素瘤細(xì)胞系內(nèi)，有關(guān)JNK/SAPK參與介導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)對(duì)黑素合成的調(diào)節(jié)作

4、用尚未見報(bào)道。 ㈢本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚在單獨(dú)的MC以及KC-MC共培養(yǎng)模型中的抗黑素合成作用有明顯差異，對(duì)共培養(yǎng)模型中黑素合成的抑制作用弱于對(duì)MC細(xì)胞中抑制作用，提示丹皮酚可能通過KC細(xì)胞間接影響MC細(xì)胞，從而削弱了其對(duì)黑素合成的抑制作用。因此我們利用單獨(dú)KC、MC培養(yǎng)以及KC-MC共培養(yǎng)模型進(jìn)一步研究這種差異的可能原因。KC細(xì)胞主要通過其分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)(主要包括ET-1和sSCF等)調(diào)節(jié)MC的黑素合成。在本研究中，

5、我們利用已知的能夠影響黑素合成的藥物(HQ、丹皮酚、8-MOP、L-酪氨酸、熊果苷和煙酰胺)作用于單獨(dú)KC、MC培養(yǎng)以及KC-MC共培養(yǎng)模型，檢測(cè)不同藥物作用后，單獨(dú)培養(yǎng)的KC細(xì)胞模型和KC-MC共培養(yǎng)模型中ET-1和sSCF水平的變化，從而探討MC單細(xì)胞模型和KC-MC共培養(yǎng)模型對(duì)藥物作用產(chǎn)生不同反應(yīng)的可能原因，并為探討黑素合成反饋機(jī)制提供基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，正是由于KC的存在，使得干預(yù)物對(duì)單獨(dú)MC模型和KC-MC共培養(yǎng)模型中黑素合成

6、的作用出現(xiàn)了明顯的差異。藥物作用72h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在KC-MC共培養(yǎng)模型中，HQ可以同時(shí)顯著減少KC合成ET-1和sSCF；而熊果苷雖然在抑制KC合成sSCF上和HQ作用相當(dāng)，但是其對(duì)ET-1的抑制作用不如HQ；而丹皮酚對(duì)模型合成ET-1和sSCF則均無影響。同樣作為促黑素合成干預(yù)物，酪氨酸可以促進(jìn)細(xì)胞因子ET-1分泌，而8-MOP反而抑制了共培養(yǎng)模型合成ET-1。以上結(jié)果提示在共培養(yǎng)模型中，KC在一定程度上影響著藥物對(duì)黑素合成的作用，

7、而這種作用可以是拮抗的也可以是協(xié)同的，很大程度上取決于藥物在共培養(yǎng)模型中對(duì)KC的影響，這種影響可能和藥物本身的生物活性相關(guān)。說明在研究、篩選和開發(fā)抗色素異常性疾病的治療藥物時(shí)，選擇KC-MC共培養(yǎng)模型比單一MC培養(yǎng)模型更能反映被選化合物的活性。該結(jié)果對(duì)指導(dǎo)新藥研發(fā)具有一定意義。 ㈣篩選了10、20和50μM濃度的8-MOP作為正相的干擾信息(增加黑素合成)。篩選10和20μM濃度的PTU作為負(fù)相的干擾信息(減少黑素合成)，利用此

8、兩種藥物作為干擾信息，結(jié)合KC-MC共培養(yǎng)模型我們構(gòu)建了一個(gè)閉環(huán)系統(tǒng)，檢測(cè)并分析了72h后模型內(nèi)黑素含量(輸出變量)的改變和模型內(nèi)細(xì)胞因子ET-1和sSCF(反饋信息)變化的關(guān)系。結(jié)果表明，變量黑素的改變影響了體系內(nèi)ET-1的水平，各組的ET-1水平和黑素含量形成明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.858)，并證明ET-1能夠促進(jìn)黑素合成，結(jié)果論證了KC-MC共培養(yǎng)體系中反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的存在。本研究得出了關(guān)于黑素沉著的新的機(jī)制，即由MC、KC、黑素以及

9、KC源性細(xì)胞因子構(gòu)成的一個(gè)完整的反饋體系：KC通過自身分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)黑素沉著[95]，當(dāng)環(huán)境刺激(干擾信息)作用于MC(控制系統(tǒng))時(shí)，MC合成并轉(zhuǎn)運(yùn)到KC內(nèi)的黑素的量(輸出變量)發(fā)生改變，KC(受控系統(tǒng))感受到了這種改變，產(chǎn)生或減少細(xì)胞因子ET-1的合成分泌(反饋信息)，反饋信息作用于MC，從而調(diào)節(jié)黑素合成。由此可推測(cè)，在表皮內(nèi)的表皮黑素單位中，MC合成黑素并轉(zhuǎn)運(yùn)到KC，而KC通過自身分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)MC，MC通過所合成的黑素調(diào)節(jié)

10、KC分泌細(xì)胞因子，以達(dá)到局部內(nèi)環(huán)境的平衡。這種調(diào)控應(yīng)答外界環(huán)境及干擾物對(duì)黑素沉著的調(diào)節(jié)。當(dāng)某種外界因素(在一定的范圍之內(nèi))作用于表皮黑素單位時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，使黑素沉著保持在一定的水平。當(dāng)刺激過強(qiáng)時(shí)，超出反饋控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力，原有的平衡被打破，黑素沉著產(chǎn)生異常。 本研究提出并論證了黑素沉著中反饋控制系統(tǒng)及反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的存在，對(duì)黑素沉著整體機(jī)制形成了必要的補(bǔ)充，有助于更全面地了解皮膚生理及色素異常性皮膚病的發(fā)病機(jī)理；并對(duì)