阻止Aβ沉積對(duì)阿爾茨海默病突觸結(jié)構(gòu)與功能的影響.pdf

1、目的:阿爾茨海默病是一種在全球范圍內(nèi)影響了至少44，000，000人的癡呆的一種疾病。它是以老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失作為特征性病理改變的神經(jīng)退行性病變。雖然阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有完全研究清楚，但是其中淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說(shuō)已經(jīng)是其發(fā)病機(jī)制的一種重要的理論。在眾多研究者的努力下，關(guān)于淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說(shuō)已經(jīng)得到了許多的研究進(jìn)展。有許多關(guān)于淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說(shuō)的證據(jù)表明，Aβ蛋白的聚集形式可以引起tau蛋白的聚集和神經(jīng)纖維

2、的退行性變。為了清除老年斑或者預(yù)防Aβ蛋白在腦組織中的沉積，研究者們做出了許多嘗試。已經(jīng)有相關(guān)的研究成功地清除了老年斑，獲得了相當(dāng)?shù)难芯窟M(jìn)展。使用Aβ疫苗進(jìn)行免疫已經(jīng)被證明可以用來(lái)清除老年斑或者用來(lái)預(yù)防老年斑的形成。有許多相關(guān)研究表明，老年斑可以引起突觸損害。老年斑的減少可以增加突觸素和NMDAR2B的表達(dá)水平。突觸素位于突觸前膜，而NMDR2B則位于突觸后膜。突觸素和NMDAR2B的表達(dá)可以反映突觸的可塑性。這些突觸相關(guān)蛋白可以影響突

3、觸的功能和認(rèn)知功能。改善突觸的功能對(duì)于治療阿爾茨海默病來(lái)說(shuō)，是重要的研究目標(biāo)。有許多研究都表明，通過(guò)Aβ疫苗免疫的方式減少老年斑可以提高突觸功能并預(yù)防認(rèn)知功能的損害。構(gòu)建一種能夠產(chǎn)生持續(xù)的預(yù)防Aβ蛋白沉積和突觸損害的疫苗也是非常重要的。在最初嘗試使用Aβ1-42肽疫苗進(jìn)行免疫之后，有許多其他種類的Aβ蛋白疫苗被研制出來(lái)。AN1792疫苗的主要組成成分是Aβ1-42肽，它的T細(xì)胞抗原決定簇引起了急性的腦膜腦炎，這種抗原決定簇目前被認(rèn)為是位

4、于Aβ蛋白的第15-42個(gè)氨基酸區(qū)域。T細(xì)胞抗原決定簇可能會(huì)引起Th1型免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)可能會(huì)引起腦組織中的炎癥發(fā)生。因此，許多新型的疫苗都是以Aβ1-15片段作為基礎(chǔ)進(jìn)行研制的。為了建立一種有效清除Aβ沉積并預(yù)防突觸損害的疫苗，本研究構(gòu)建了Aβ3-10-KLH多肽疫苗。通過(guò)水迷宮的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，Aβ3-10-KLH疫苗提高了轉(zhuǎn)基因鼠的認(rèn)知功能。Aβ3-10-KLH疫苗引起了高水平的抗Aβ抗體并減少了APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦組織

5、中的老年斑含量。通過(guò)在透射電子顯微鏡下觀察突觸的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，突觸的結(jié)構(gòu)也得到了改善。同時(shí)，突觸相關(guān)蛋白也由Aβ3-10-KLH多肽疫苗提高了表達(dá)水平。本研究提供了能夠降低由老年斑引起的突觸損害的新型疫苗，并且提供了更多的關(guān)于淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說(shuō)的相關(guān)證據(jù)。
　　研究方法:Aβ3-10-KLH疫苗由血藍(lán)蛋白(KLH)與Aβ3-10肽相結(jié)合，于南京金斯康公司合成。將Aβ3-10-KLH多肽疫苗和Aβ1-42肽疫苗通過(guò)皮下注射的方式

6、免疫APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠。PBS以同樣的方式被注射入小鼠，作為陰性對(duì)照組。本研究使用ELISA方法檢測(cè)抗Aβ抗體的濃度。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠的認(rèn)知功能，使用Morris水迷宮，并且用野生型鼠作為對(duì)照組。小鼠腦組織中的Aβ沉積的量、突觸素和NMDAR2B的表達(dá)量是通過(guò)免疫組化染色的方式進(jìn)行測(cè)定的。本研究使用了透射電子顯微鏡觀察突觸的超微結(jié)構(gòu)。為了確定Aβ3-10-KLH多肽疫苗的持續(xù)性免疫效應(yīng)，本研究對(duì)停止免疫后四個(gè)月的10月齡的小鼠進(jìn)行

7、了檢測(cè)。使用Morris水迷宮檢測(cè)10月齡APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能，并檢測(cè)其Aβ沉積的量、突觸素和NMDAR2B的表達(dá)量，同時(shí)與10月齡的PBS對(duì)照組小鼠進(jìn)行結(jié)果的對(duì)比。
　　結(jié)果:1、在使用Aβ3-10-KLH疫苗和Aβ1-42肽疫苗進(jìn)行5次免疫之后，APP/PS1小鼠進(jìn)行了水迷宮的行為學(xué)檢測(cè)。PBS對(duì)照組小鼠和野生型小鼠都分別用作對(duì)照組。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能通過(guò)Aβ3-10-KLH疫苗的免疫，得到了顯著的改善

8、。這種改善的程度同Aβ1-42肽疫苗組相比，沒(méi)有明顯差異。2、停止免疫之后的四個(gè)月，10月齡的雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行水迷宮行為學(xué)檢測(cè)。與PBS對(duì)照組小鼠相比，Aβ3-10-KLH免疫后的小鼠表現(xiàn)出了持續(xù)性的改善認(rèn)知功能的效果。3、經(jīng)過(guò)五次Aβ3-10-KLH疫苗和Aβ1-42肽疫苗免疫之后，APP/PS1小鼠的腦組織通過(guò)免疫組化染色進(jìn)行了檢測(cè)。PBS組小鼠和野生型小鼠作為對(duì)照組。Aβ3-10-KLH免疫后的小鼠的腦內(nèi)Aβ沉積量顯著下降。Aβ3

9、-10-KLH疫苗免疫組對(duì)Aβ斑塊的減少程度與Aβ1-42肽組相比沒(méi)有明顯差異。4、停止免疫后四個(gè)月，10月齡的Aβ3-10-KLH免疫組鼠和PBS對(duì)照組小鼠的腦組織通過(guò)免疫組化的方式進(jìn)行了檢測(cè)。與PBS對(duì)照組鼠相比，Aβ3-10-KLH免疫后的小鼠的腦內(nèi)Aβ沉積被持續(xù)的抗Aβ效果而顯著減少。5、抗Aβ抗體可以通過(guò)ELISA的方法進(jìn)行檢測(cè)，Aβ3-10-KLH疫苗引起了高水平抗體濃度。6、通過(guò)免疫組化染色的方式檢測(cè)突觸素的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Aβ

10、3-10-KLH疫苗提高了突觸素的表達(dá)量。本研究發(fā)現(xiàn)，在Aβ3-10-KLH免疫組和Aβ1-42肽免疫組之間相比，其突觸素表達(dá)量顯著增高。Aβ3-10-KLH疫苗可以保護(hù)突觸前膜的突觸相關(guān)蛋白，且效果好于Aβ1-42肽。7、通過(guò)免疫組化染色的方式檢測(cè)NMDAR2B的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Aβ3-10-KLH疫苗提高了NMDAR2B的表達(dá)量。本研究發(fā)現(xiàn)，在Aβ3-10-KLH免疫組和Aβ1-42肽免疫組之間相比，其NMDAR2B表達(dá)量顯著增高。Aβ3

11、-10-KLH疫苗可以保護(hù)突觸后膜的突觸相關(guān)蛋白，且效果好于Aβ1-42肽。8、通過(guò)透射電子顯微鏡觀察突觸的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，突觸的密度和突觸后膜厚度被 Aβ3-10-KLH疫苗免疫后顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)以上指標(biāo)在Aβ3-10-KLH組與Aβ1-42肽組之間具有顯著差異，Aβ3-10-KLH對(duì)突觸結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用好于Aβ1-42肽組。9、本研究檢測(cè)了10月齡小鼠中的突觸素和NMDAR2B的表達(dá)。與PBS對(duì)照組小鼠相比，突觸素和NMDAR2B的

12、表達(dá)在Aβ3-10-KLH組小鼠中顯著增加。
　　結(jié)論:1、Aβ3-10-KLH疫苗可以改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能，其改善的程度與Aβ1-42肽組的改善水平并無(wú)明顯差異。2、Aβ3-10-KLH疫苗可以改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能且表現(xiàn)出持續(xù)的改善阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能的效果。3、APP/PS1小鼠的Aβ沉積可以被Aβ3-10-KLH疫苗顯著地減少。Aβ3-10-KLH疫苗組與Aβ1-42肽組相比，二者減少Aβ沉積的程

13、度無(wú)明顯差異。4、最后一次免疫后四個(gè)月，檢測(cè)小鼠腦組織內(nèi)的Aβ沉積水平發(fā)現(xiàn)，Aβ3-10-KLH疫苗可以產(chǎn)生持續(xù)預(yù)防APP/PS1小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積的作用。5、抗Aβ抗體的濃度可以通過(guò)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，Aβ3-10-KLH引起了高水平的抗Aβ抗體。6、Aβ3-10-KLH疫苗組小鼠腦組織內(nèi)的突觸素和NMDAR2B的表達(dá)被顯著增加。Aβ3-10-KLH疫苗可以幫助保護(hù)突觸結(jié)構(gòu)，其效果好于Aβ1-42肽疫苗。7、通過(guò)透射電子顯微鏡檢測(cè)