新金色分枝桿菌中AD轉(zhuǎn)化為ADD關(guān)鍵酶KSDD的研究.pdf

1、甾體藥物作為僅次于抗生素第二大類藥物,在日常生活中具有很廣泛的應(yīng)用。雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-end-3,17-dione,AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androst-1,4-end-3,17-dione,ADD)是微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇過程中的重要產(chǎn)物,是重要的甾體藥物中間體,可以作為合成甾體藥物的前體物質(zhì)。3-甾酮-△1-脫氫酶(KSDD)是微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇過程中的關(guān)鍵酶,對AD(D)合成有重要

2、影響。本實驗室保藏了一株能夠轉(zhuǎn)化植物甾醇為AD(D)的新金色分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum),因此以該菌為基礎(chǔ)從多個方面對KSDD的性質(zhì)和功能進行了研究。
　　 首先克隆了該菌株KSDD編碼基因ksdD的1.7 kb全序列,連接pET-28a表達載體后在大腸桿菌E. coli BL21中誘導(dǎo)表達,但是表達出的KSDD酶蛋白以無活性的包涵體形式存在。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件,降低蛋白表達量,KSDD重組蛋白仍然以包

3、涵體形式存在。
　　 為了驗證ksdD基因在分枝桿菌中的功能,利用PCR方法擴增出pET-28a質(zhì)粒上1.4kb的卡那霉素抗性基因Km,構(gòu)建了非復(fù)制型整合載體pMD18-T-ksdD::Km用于敲除ksdD基因。電擊轉(zhuǎn)化分枝桿菌M.neoaurum JC-12,經(jīng)過表型和基因型驗證,證實了原始菌株M.neoaurum JC-12中ksdD基因缺失。對菌株生長曲線測定顯示,ksdD基因缺失對重組菌生長無影響;酶活檢測顯示重組菌KS

4、DD酶活為15.6 mU/mg,與原始菌株相比下降了85％;甾醇轉(zhuǎn)化實驗發(fā)現(xiàn)重組菌AD產(chǎn)量為0.336 g/L,與原始菌株相比提升了1倍。
　　 為了實現(xiàn)ksdD基因在分枝桿菌M.neoaurum中的過量表達,將ksdD基因置于卡那霉素抗性基因啟動子Pkan下游,并利用該菌的16S rDNA序列作為整合區(qū)域,構(gòu)建了載體pETPkan-ksdD-16SrDNA。電擊轉(zhuǎn)化分枝桿菌M.neoaurum JC-12,經(jīng)過表型和基因型驗證