結(jié)核分枝桿菌GysE的酶促反應(yīng)特性分析.pdf

1、上世紀(jì)八十年代以來(lái),由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染而引發(fā)的結(jié)核病(Tuberculosis,TB)在世界范圍內(nèi)再次重現(xiàn)流行趨勢(shì),嚴(yán)重危害公共健康。艾滋病與結(jié)核病之間的協(xié)同作用,以及多重耐藥性結(jié)核分枝桿菌的不斷增加,使得現(xiàn)有的抗結(jié)核治療方案不能達(dá)到有效治愈的目的?？菇Y(jié)核新藥的發(fā)現(xiàn)距今已超過(guò)四十年,現(xiàn)今迫切需要發(fā)現(xiàn)新的抗結(jié)核藥物靶點(diǎn),研制開發(fā)新型抗結(jié)核藥物。
　　 絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶Cys

2、E普遍存在于植物及微生物體中,但在哺乳類動(dòng)物中沒有發(fā)現(xiàn)。該酶參與催化生物體中半胱氨酸合成的第一步反應(yīng)(如圖1所示),即以L-絲氨酸(L-Serine)及乙酰輔酶A(AcCoA)為底物催化生成氧-乙酰絲氨酸(O-acetyl-L-Ser)和輔酶A(CoASH),第二步反應(yīng)由氧-乙?；?L-絲氨酸硫化氫解酶(O-acetyl-L-Ser sulfhydrylase)催化生成L-半胱氨酸(L-cysteine)。結(jié)核分支桿菌絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶

3、CysE屬于結(jié)核分枝桿菌正常生長(zhǎng)所需酶類,其突變可影響菌株的正常生長(zhǎng),是一個(gè)潛在的新型抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)。
　　 本論文目的是:(1)用PCR方法以結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板擴(kuò)增Tb cysE基因;(2)將Tb cysE基因克隆到pMD18-T克隆載體,并進(jìn)行DNA序列測(cè)定;(3)將Tb cysE基因亞克隆到表達(dá)載體pET29b中,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)CysE蛋白;(4)采用親和層析方法純化CysE蛋白,并用

4、Western blotting方法進(jìn)行鑒定:(5)建立測(cè)定CysE酶活性的方法;(6)確定CysE酶的最佳反應(yīng)條件并進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km、Vmax的測(cè)定。
　　 本論文所獲的結(jié)果如下:
　　 1.利用PCR方法擴(kuò)增目的基因Tb cysE從結(jié)核分枝桿菌 H37Rv菌株的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http://genolist.pasteur.fr/TubercuList)中獲得基因Tb cysE核苷酸序列(690bp)。

5、據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物,并在上下游引物的5’端分別引入NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(以便將Tb cysE基因克隆到pET29b表達(dá)載體的NdeI和XhoI位點(diǎn))。以菌株H37Rv基因組DNA為模板,用LA TaqDNA聚合酶成功擴(kuò)增出Tb cysE基因。
　　 2.構(gòu)建重組克隆載體pMD18-Tb eysE并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定將已純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌NovaBlue菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。

6、用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。對(duì)pMD18-Tb cysE中的Tb-cysE基因進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,并進(jìn)行Multalin.分析,結(jié)果表明所克隆的Tb-cysE基因與結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中Tb cysE基因的核苷酸序列一致,即利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出的Tb cysE基因不存在堿基突變。
　　 3.構(gòu)建重組表達(dá)載體pET29b-Tb cysE用NdeI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pMD18-Tb cysE,回收純化目的

7、片段Tb-cysE基因,將其連接到表達(dá)載體pET29b的NdeI和XhoI位點(diǎn),構(gòu)建pET29b-Tb cysE表達(dá)質(zhì)粒。用EcoRI和XhoI雙酶切方法鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒,將要表達(dá)的重組CysE蛋白的C端與質(zhì)粒上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。
　　 4.用大腸桿菌BL21(DE3)菌株表達(dá)Tb CysE蛋白并純化將質(zhì)粒pET29b-Tb cysE轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Tb CysE蛋白。超聲破碎BL

8、21(DE3)誘導(dǎo)菌株細(xì)胞,對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析,結(jié)果表明CysE蛋白在BL21(DE3)中可溶性表達(dá)。
　　 采用組氨酸-鎳柱親和層析技術(shù)純化CysE蛋白,對(duì)純化蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(考馬斯亮藍(lán)法),第1ml所純化CysE蛋白的濃度為37ug/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明CysE蛋白的純度較高。
　　 5.CysE酶活性測(cè)定方法

9、的建立
　　 向酶反應(yīng)體系中加入DTNB(Ellman’s Reagent),用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)定光吸收值的變化,進(jìn)而得出反應(yīng)產(chǎn)物HSCoA生成量。
　　 6.CysE酶的相關(guān)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究
　　 (1)初速度的確定:
　　 將反應(yīng)底物L(fēng)-Ser、AcCoA與不同濃度CysE蛋白在37℃反應(yīng)不同時(shí)間,繪制酶濃度曲線及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線。結(jié)果表明CysE絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)初速度酶濃度范圍為0.74u

10、g/ml,時(shí)間范圍為5min。
　　 (2)CysE酶促反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件的確定
　　 分別改變反應(yīng)的溫度和反應(yīng)體系的pH值,測(cè)定產(chǎn)物HSCoA生成量。CysE絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶催化的最適溫度為37℃,最適pH值為7.5,該酶活性不需要Mg2+的參與。
　　 (3)最佳反應(yīng)條件下CysE酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定
　　 在最佳反應(yīng)條件及酶促反應(yīng)初速度范圍,保證一種底物過(guò)量,同時(shí)改變另一底物的濃度進(jìn)行反應(yīng)。采

11、用雙倒數(shù)法分別測(cè)定兩底物的Km、Vmax值。底物AcCoA的Km值為0.051335±0.00499mM,最大速率Vmax值為0.008189+0.00047mM-1min;L-Ser的Km值為0.026405±0.00063mM,Vmax值為0.006455±0.00047mM-1min。
　　 結(jié)論:
　　 在本研究中,構(gòu)建了pET29b-Tb cysE重組表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)出可溶性蛋