新金分枝桿菌ZJUVN-08轉(zhuǎn)化植物甾醇合成雄甾烯二酮的研究.pdf

1、甾體類激素藥物是我國(guó)醫(yī)藥領(lǐng)域的重要門類，雄甾烯二酮(AD)是甾體激素類藥物不可替代的中間體。微生物選擇性降解植物甾醇(PS)側(cè)鏈生成AD，能替代復(fù)雜的多步化學(xué)合成法，并減輕目前由于薯蕷皂素為原料造成的資源緊缺，對(duì)合理利用我國(guó)甾體植物資源、推動(dòng)制藥行業(yè)的發(fā)展有著重要意義。本文對(duì)分離得到能轉(zhuǎn)化植物甾醇合成AD的菌株進(jìn)行性能比較，并對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行鑒定與N+離子注入誘變選育，獲得1株僅積累產(chǎn)物AD的菌株(新金分枝桿菌，命名為ZJUVN-08)。

2、利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化；通過(guò)幾種不同的細(xì)胞通透性調(diào)節(jié)手段，提高新金分枝桿菌細(xì)胞壁的通透性，以期增加AD產(chǎn)量；比較了水相系統(tǒng)中幾種不同促溶劑對(duì)植物甾醇轉(zhuǎn)化的影響，并借助響應(yīng)面分析方法對(duì)添加羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)的生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化；研究了水相體系中靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物甾醇的最佳條件。論文的主要研究結(jié)果如下：
　　 取山東泰安市郊幾家植物油廠附近污染較為嚴(yán)重的土壤樣品，后經(jīng)富集培養(yǎng)和涂布

3、平板等方法，分離得到76株能夠在以植物甾醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析和高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)菌株ZJUVN的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)量最高，且產(chǎn)物AD和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的比例約為10:1。經(jīng)過(guò)菌株形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rDNA序列分析方法對(duì)菌株ZJUVN進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示該菌為新金分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum.ZJUVN)。
　　 利用N+離子束注入技

4、術(shù)對(duì)新金分枝桿菌ZJUVN進(jìn)行誘變，通過(guò)不同注入劑量與誘變致死率的關(guān)系曲線確定N+離子束注入的最佳條件為：能量10 keV，誘變劑量100×2.6×1013ions/cm2，致死率約在70％。
　　 選擇在平板篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的單菌落，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，得到23株積累產(chǎn)物AD而幾乎沒(méi)有副產(chǎn)物ADD的突變株，其中突變株ZJUVN-08的AD產(chǎn)量為2.29 g/L，比出發(fā)菌株提高71.05％。10次傳代過(guò)程中，AD產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，

5、表明該菌有較好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 利用正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)突變株M.neoaurum ZJUVN-08的培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定合適培養(yǎng)基組成為：葡萄糖1％，蛋白胨0.6％，磷酸氫二鉀0.15％，硫酸鎂0.05％，硫酸亞鐵0.007％。確定了最佳轉(zhuǎn)化條件為：初始pH值7.0，溫度30℃，10％的接種量，裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速為200 rpm。對(duì)ZJUVN-08的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物利用制備型HPLC進(jìn)行分離純化，制得白色粉末結(jié)

6、晶，通過(guò)MS，IR和NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果證明純化產(chǎn)物為AD。
　　 對(duì)比了超聲、桿菌肽、魚(yú)精蛋白和甘氨酸處理對(duì)菌體生長(zhǎng)及底物轉(zhuǎn)化能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲功率為500 W，超聲時(shí)長(zhǎng)為180 s時(shí)，發(fā)酵液中AD產(chǎn)量為2.95 g/L，比對(duì)照提高了5.8％。桿菌肽處理菌體后，幾種參試濃度下，均會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，且AD產(chǎn)量低于對(duì)照水平。10 mg/L魚(yú)精蛋白處理菌體后，發(fā)酵液中AD產(chǎn)量最高為3.02 g/L，比對(duì)照提高了8.6％。5

7、 g/L的甘氨酸有利于菌體的生長(zhǎng)，且有利于提高菌體轉(zhuǎn)化底物的能力，發(fā)酵液中AD產(chǎn)量最高為3.16 g/L，比對(duì)照提高了13.6％。并通過(guò)藥敏性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了甘氨酸是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞通透性的方式提高了底物的轉(zhuǎn)化能力。
　　 探討了水相體系中不同助溶劑對(duì)植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化的影響，確定了添加HP-β-CD的體系中植物甾醇轉(zhuǎn)化效果最好；進(jìn)一步采用響應(yīng)面法對(duì)添加HP-β-CD的水相體系轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳轉(zhuǎn)化條件為誘導(dǎo)物濃度0.1 g

8、/L、初始pH7.0，HP-β-CD/PS摩爾比1.92:1，底物濃度8.89 g/L，轉(zhuǎn)化時(shí)間120 h，在該條件下轉(zhuǎn)化植物甾醇時(shí)，得到AD產(chǎn)量最大值為5.96 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為94.69％。比未優(yōu)化前有效節(jié)約了底物和HP-β-CD的用量，同時(shí)獲得了較高的產(chǎn)量。
　　 進(jìn)一步研究了水相體系中誘變菌株M.neoaurum ZJUVN-08靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物甾醇的條件，確定靜息細(xì)胞菌齡為72 h，細(xì)胞濃度45 g/L、pH為7.