分枝桿菌降解植物甾醇側(cè)鏈過程基礎(chǔ)研究.pdf

1、植物甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)是甾體轉(zhuǎn)化領(lǐng)域主要研究方向之一，其產(chǎn)物雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)在甾體藥業(yè)中占有重要地位，因為從它們出發(fā)幾乎可以合成所有的甾體激素類藥物。采用微生物發(fā)酵法降解植物甾醇側(cè)鏈，生產(chǎn)AD(D)等甾體類藥物中間體是目前的研究熱點，但甾體底物水溶性差限制了微生物法的大規(guī)模應(yīng)用。本文利用分枝桿菌Mycobacterium sp.MB3683對植物甾醇側(cè)鏈降解過程進行研究，以

2、改善底物溶解性，實現(xiàn)高濃度下的植物甾醇側(cè)鏈降解過程。
　　首先建立了產(chǎn)物AD的HPLC分析方法，該方法操作簡單、重復(fù)性好、結(jié)果可靠。測定了分枝桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線。對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件包括碳源、氮源和pH等進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度高時不利于甾體的轉(zhuǎn)化，而氮源(NH4)2HPO4對AD產(chǎn)率的影響較小，但對維持體系的pH非常重要。并確定適宜的發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間為168 h。
　　其次選取多種有機溶劑、環(huán)糊精及其衍生物作為增溶劑

3、，以探討不同甾醇底物對增溶劑的偏好性，并對增溶劑添加時間、添加量、底物的投料濃度等操作條件進行了研究。結(jié)果表明，植物甾醇（混合甾醇）最適于作為轉(zhuǎn)化底物;不同甾醇底物對增溶劑無明顯偏好性。有機溶劑作為增溶劑時，乙醇和丙酮在提高產(chǎn)率方面優(yōu)于其它有機溶劑;而環(huán)糊精作為增溶劑時，甲基-β-環(huán)糊精效果最好，在底物濃度高達(dá)15g/L時，產(chǎn)率仍不低于60％，且發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間縮短至96 h。
　　最后選取8種植物油構(gòu)建了油/水兩相體系用于側(cè)鏈降解反

4、應(yīng)。分別測定了產(chǎn)物AD在各體系中的分配系數(shù)，logD值均處于2.0-3.0之間。在底物濃度為10g/L時，葵花油和玉米油系統(tǒng)中的摩爾產(chǎn)率均超過了80％，其它油水兩相系統(tǒng)中也可達(dá)到70％。在此基礎(chǔ)上，選取葵花油/水兩相系統(tǒng)作為研究對象，對相比、接種量、投料時間和發(fā)酵時間等重要參數(shù)進行了探索。結(jié)果表明在相比1∶9，接種量8％，48h投料時，轉(zhuǎn)化效果最好，且轉(zhuǎn)化時間縮短至120h。在高濃度的底物(20 g/L)條件下，產(chǎn)率仍有45％，充分證明