TNF-α預處理骨髓間充質干細胞抑制小膠質細胞活化治療神經病理性疼痛的研究.pdf

1、神經病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)發(fā)病機制復雜，傳統(tǒng)的抗炎藥、鈣離子通道拮抗劑、三環(huán)類抗抑郁藥等，在NPP的治療中非常局限，這使得NPP的治療成為臨床上亟待解決的問題。骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)因其獨特的生物學特點和優(yōu)勢如：增殖率高、遺傳穩(wěn)定、低免疫原性、免疫調節(jié)作用等特點，而直接用于神經病理性疼痛等疾病的治療。但BMMSCs發(fā)揮治療作用

2、的機制尚不明確。研究表明小膠質細胞(Microglia，MG)在微量促炎因子作用下即可活化，活化后的MG可釋放大量主導NPP發(fā)生與進展的炎性介質。因此，調節(jié)MG過度活化成為治療NPP的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可被移植微環(huán)境中的促炎因子激活，通過自身旁分泌功能抑制MG過度活化進而減輕NPP的發(fā)展。但目前促炎因子預處理BMMSCs作用于NPP的研究較少。因此，研究預處理BMMSCs在NPP的發(fā)病過程中的作用具有重要意義。
　　實驗目

3、的：
　　探討TNF-α預處理的BMMSCs對CCI大鼠鎮(zhèn)痛作用及可能機制
　　實驗內容：
　　1、培養(yǎng)并鑒定BMMSCs。
　　2、體外情況下TNF-α預處理BMMSCs對其抑制MG活化作用的影響
　　3、鞘內注射經TNF-α預處理的BMMSCs對CCI大鼠MG活化及疼痛行為的影響
　　實驗方法：
　　1、采用貼壁分離法從雄性SD大鼠（3-4周齡）的股骨中分離BMMSCs。光鏡下觀察細胞形態(tài)、

4、流式細胞學技術檢測細胞表面標記物對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
　　2、選擇雄性SD大鼠（6-8周齡）120只，參照Bennett法制備CCI模型，隨機分為3組(n=40);①CCI組（A組）：造模后第7天鞘內注射不含BMMSCs的PBS20μl;②BMMSC移植組（B組）：造模后第七天鞘內注射含BMMSCs（1×106/只）的PBS20μl;③TNF-α預處理BMMSCs組（C組）：造模后第七天鞘內注射含TNF-α處理后的BMMSCs

5、（1×106/只）的PBS20μl。
　　3、觀察各組大鼠在手術前1天，術后第3、7、14、21、28天PWL、PWT。
　　4、分別于手術前一天，術后第3、7、14、21、28天采用頸椎脫臼法處死大鼠，分別取大鼠脊髓(SL)、腰段背根神經節(jié)(DRG)。采用ELISA技術檢測SL、DRG內TNF-α、IL-6、IL-10炎性因子水平;分別于術后14天取SL、DRG，采用免疫熒光技術檢測SL、DRG小膠質細胞表面標記物CD68

6、的表達水平。
　　5、為進一步驗證BMMSCs對小膠質細胞的影響，體外情況下采用LPS誘導MG活化，采用共培養(yǎng)的方法來檢測BMMSCs對LPS活化后的MG的作用。利用含1000ng/ml的TNF-α完全培養(yǎng)液對BMMSCs進行預處理;利用LPS（10μg/ml）誘導大鼠MG活化。MG分離純化后，以1×105/孔種植于6孔板中，按以下分組將MG和BMMSCs進行共培養(yǎng)24h。B組（單純BMMSCs組）、L+B組（LPS+BMMSCs

7、組）、T+B組（TNF-α預處理BMMSCs組）、L+T+B組（LPS+TNF-α預處理BMMSCs組）、M組（單純MG組）、L+M組（LPS+MG組）、B+L+M組(BMMSCs+LPS+MG組)、T+B+L+M組(TNF-α預處理BMMSCs+LPS+MG組)。
　　6、24h后，取培養(yǎng)液上清，采用ELISA技術檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子表達含量，免疫熒光法檢測MG表面標記物CD68抗體的表達水平。

8、
　　實驗結果：
　　1、采用貼壁分離法培養(yǎng)的BMMSCs，隨著細胞不斷傳代純化，細胞形態(tài)呈長梭狀且呈旋渦狀排列，細胞表型鑒定結果如下：CD29表達率99.59％，CD90表達率83.95％，呈陽性;CD34表達率0.1％，CD45表達率7％，呈陰性。
　　2、與CCI組、單純BMMSC組相比，TNF-α預處理BMMSCs組術前1天、術后28天PWT和PWL差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);在術后第3天PWT和PWL逐

9、漸降低，術后第7天降至最低，之后緩慢升高，于術后28天恢復至基線水平，在此期間TNF-α預處理BMMSCs術后7、14、21天PWT、PWL值均升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。肉眼可見TNF-α預處理BMMSCs組大鼠精神狀態(tài)好，術側傷口恢復較快;與CCI組和單純BMMSC組相比，差異顯著。
　　3、BMMSCs移植后進行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：TNF-α預處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經節(jié)內TNF-α、IL-6等促炎

10、因子含量在術后第3、7天明顯升高，術后第14、21天促炎因子含量逐漸降低，術后28天促炎因子含量達到基線水平，與CCI組和單純BMMSC組相比，差異有明顯統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。然而，TNF-α預處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經節(jié)內抑炎因子IL-10在術后第3、7表達呈低水平，在術后第14天逐漸上升，21天達到高峰，術后28天基本降至術前水平，與CCI組和單純BMMSC組相比，差異有明顯統(tǒng)計學意義(p＜0.05)
　　

11、4、與CCI組和單純BMMSC組相比，SL、DRG中小膠質細胞CD68表達水平明顯降低(p＜0.05)，而CD68在CCI組和單純BMMSC表達無明顯變化。
　　5、L+M組小膠質細胞的CD68表達增高，分泌TNF-α、IL-6含量明顯增多;B+L+M組以及T+B+L+M組的小膠質細胞CD68表達水平、TNF-α、IL-6分泌量低于L+M組，且B+L+M組與T+B+L+M組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　實驗結論：<