TNF-α通過microRNAs導(dǎo)致骨質(zhì)疏松中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化缺陷的機制研究.pdf

1、【背景】
　　絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是最常見的骨質(zhì)疏松，主要表現(xiàn)為絕經(jīng)后出現(xiàn)的骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞和力學(xué)性能減退?？稍斐煞菓?yīng)力性骨折高發(fā)，是危害中老年女性健康和生命的主要退行性疾病之一。骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因是破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成間的平衡破壞。以往對于骨質(zhì)疏松的研究主要集中于終末分化的功能細(xì)胞。但近期研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ Bone marrow-derived mesenchymal stem cells

2、，BMSCs）作為成骨前體細(xì)胞的來源，在骨發(fā)育、改建和修復(fù)再生中均發(fā)揮重要作用。已有研究證實，在骨質(zhì)疏松中BMSCs的成骨分化能力下降，是導(dǎo)致骨形成缺陷的重要原因。但是引起B(yǎng)MSCs分化功能異常的機制亟待闡明。
　　最新研究表明，雌激素主要通過間接作用影響骨形成。雌激素對于輔助性 T細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其缺乏后引起的炎性因子增加是骨質(zhì)疏松發(fā)生的關(guān)鍵致病因素。其中，腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis fact

3、or-alpha，TNF-α）是最主要的炎性因子之一，通過基因敲除或中和抗體等方法抑制TNF-α可有效預(yù)防雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松。此外，TNF-α已被證實可以抑制BMSCs的成骨分化，但是因為TNF-α作用廣泛、下游信號通路復(fù)雜，其具體的分子信號途徑尚不清楚。
　　微小RNA（microRNA，miRNA）作為基因表達(dá)的重要調(diào)控手段，近年來被證實在BMSCs分化中扮演關(guān)鍵角色。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個miRNA通過作用于成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和信號

4、分子調(diào)控BMSCs成骨分化進(jìn)程。同時，在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等多種老年性疾病中均觀察到特定 miRNA的表達(dá)變化，并參與了疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。但是骨質(zhì)疏松過程中BMSCs中miRNA表達(dá)是否發(fā)生改變，其改變與骨質(zhì)疏松發(fā)生是否相關(guān)等重要問題均有待解答。
　　【目的】
　　本研究擬利用 microRNA高通量芯片檢測技術(shù)，結(jié)合分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究方法，探索TNF-α抑制BMSCs成骨分化的分子途徑，明確miRN

5、A在其中的作用及機制，為深入認(rèn)識絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生機制、探尋新的治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　【方法】
　　1、通過卵巢切除（Ovariectomy，OVX）手術(shù)建立雌激素缺乏骨質(zhì)疏松小鼠模型，利用microCT和組織學(xué)檢測明確其骨量變化；
　　2、通過體外成骨分化實驗，利用茜素紅染色和Realtime RT-PCR檢測成骨標(biāo)志基因，明確OVX小鼠來源BMSCs成骨分化能力改變；
　　3、利用ELISA檢測明確T

6、NF-α在OVX術(shù)后的水平變化；
　　4、利用Western blot檢測TNF-α下游激活的信號通路；
　　5、利用siRNA阻斷NF-κB信號通路進(jìn)行缺失性功能研究；
　　6、通過miRNA高通量芯片篩查尋找在OVX及SHAM BMSCs中差異性表達(dá)的miRNA；
　　7、利用特定miRNA mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)行獲得/缺失性功能實驗，用以確定miR-3077-5p和miR-705在BMSC

7、s分化中的作用；
　　8、利用生物信息學(xué)分析尋找miRNA作用的靶基因；
　　9、采用Western blot檢測結(jié)合熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miRNA對靶基因的直接作用；
　　10、利用雌激素體內(nèi)注射和體外處理明確miR-3077-5p和miR-705是否直接受雌激素調(diào)控；
　　11、利用重組TNF-α和TNF-α中和抗體體內(nèi)注射，明確TNF-α對miR-3077-5p和miR-705表達(dá)的調(diào)控作用及其激活的信號通

8、路；
　　12、利用TNF-α體外處理，研究TNF-α調(diào)控miR-3077-5p和miR-705表達(dá)的分子信號機制；
　　13、利用2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH-DA）標(biāo)記BMSCs內(nèi)氧自由基（reactive oxygen species，ROS），并通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測；
　　14、利用抗氧化劑NAC明確ROS對于BMSCs成骨分化的作用；
　　15、利用免疫組化檢測骨質(zhì)疏松后松質(zhì)骨

9、中叉頭結(jié)合蛋白O亞家族1（FOXO1）的表達(dá)；
　　16、利用FoxO1 siRNA干擾和慢病毒過表達(dá)技術(shù)，明確FOXO1在BMSCs抗氧化防御中的作用；
　　17、通過antogomir體內(nèi)注射體內(nèi)下調(diào)miR-705的表達(dá)，以體內(nèi)驗證miR-705的功能及其作用靶基因；18、利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)明確NF-κB信號通路是否直接調(diào)控miR-705的轉(zhuǎn)錄。
　　【結(jié)果】
　　1．骨質(zhì)疏松中TNF-α抑制BMSCs

10、成骨分化
　　OVX術(shù)后3mon，BMSCs成骨分化能力較假手術(shù)組（Sham surgery，SHAM）顯著下降。而血液中TNF-α水平在雌激素缺乏后明顯上升，體外實驗證實過量的TNF-α抑制 BMSCs成骨分化。進(jìn)一步信號通路檢測發(fā)現(xiàn) TNF-α并不激活凋亡通路，而激活NF-κB信號通路。利用IkkasiRNA抑制NF-κB通路后可有效恢復(fù)OVX BMSCs的成骨分化，并阻斷TNF-α對BMSCs成骨分化的抑制作用。
　　

11、2．TNF-α通過上調(diào)miR-3077-5p表達(dá)抑制BMSCs成骨分化
　　miRNA高通量芯片篩查發(fā)現(xiàn)10個miRNA在SHAM及OVX BMSCs中呈差異性表達(dá)，其中miR-3077-5p差異最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)miR-3077-5p在OVX BMSCs和骨組織中表達(dá)異常升高，雌激素治療可降低其在骨組織中表達(dá)，但體外雌激素處理卻促進(jìn)miR-3077-5p表達(dá)；而TNF-α顯著促進(jìn)miR-3077-5p表達(dá)，說明雌激素缺乏后間接通

12、過TNF-α提高miR-3077-5p的表達(dá)。此外，miR-3077-5p在骨組織中表達(dá)豐度高，隨BMSCs成骨分化進(jìn)程顯著下降，功能學(xué)研究證實miR-3077-5p抑制BMSCs成骨分化，主要通過直接結(jié)合于成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2 mRNA3‘非翻譯區(qū)（UTR）發(fā)揮作用。抑制miR-3077-5p有效恢復(fù)OVX BMSCs的成骨功能低下，并部分拮抗TNF-α的抑制成骨分化作用。
　　3．TNF-α通過導(dǎo)致氧化應(yīng)激間接抑制BMS

13、Cs成骨分化
　　通過體內(nèi)外實驗證實，骨質(zhì)疏松中TNF-α的升高導(dǎo)致BMSCs中ROS水平升高，抑制BMSCs成骨分化。其氧化應(yīng)激是由于SOD2、CAT等抗氧化酶表達(dá)減少、抗氧化防御缺陷所導(dǎo)致。FOXO1在骨質(zhì)疏松骨組織及BMSCs中表達(dá)均下降。通過獲得/缺失性功能實驗證實 FOXO1促進(jìn) Sod2、Cat基因表達(dá)，發(fā)揮關(guān)鍵的抗氧化作用。TNF-α抑制FOXO1的蛋白表達(dá)，導(dǎo)致OVX BMSCs氧化損傷，而過表達(dá)FOXO1可減輕O

14、VX和TNF-α所致的氧化損傷，恢復(fù)BMSCs的成骨分化功能。
　　4．TNF-α通過上調(diào)miR-705導(dǎo)致持續(xù)性氧化損傷
　　TNF-α并不直接調(diào)控FoxO1基因轉(zhuǎn)錄。體內(nèi)、體外實驗證實TNF-α促進(jìn)miR-705表達(dá)。結(jié)合生物信息學(xué)分析、獲得/缺失性功能實驗、熒光素酶報告體系證實miR-705可結(jié)合于FoxO1 mRNA3‘UTR抑制其表達(dá)。下調(diào)miR-705可提高BMSCs中FOXO1蛋白水平、Sod2和Cat mRN

15、A表達(dá)，并減輕氧化損傷。信號通路研究證實TNF-α通過激活NF-κB信號通路，促進(jìn)P65結(jié)合于miR-705啟動子激活其轉(zhuǎn)錄。此外，ROS能夠進(jìn)一步活化NF-κB通路提高miR-705表達(dá)，形成NF-κB-miR-705-FOXO1-ROS正反饋回路。TNF-α長期刺激可導(dǎo)致BMSCs持續(xù)性的氧化損傷和成骨分化缺陷。
　　【結(jié)論】
　　1．TNF-α是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中BMSCs介導(dǎo)的骨形成缺陷的重要因素。雌激素缺乏后導(dǎo)致

16、TNF-α水平升高，過量的TNF-α一方面通過抑制成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)直接抑制BMSCs的成骨分化，另一方面通過抑制FOXO1介導(dǎo)的抗氧化防護(hù)機制，造成BMSCs氧化損傷，從而間接的抑制BMSCs成骨分化功能。
　　2．絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松來源 BMSCs中部分 miRNA的表達(dá)發(fā)生顯著改變，是導(dǎo)致BMSCs成骨分化異常的重要原因。而TNF-α可通過影響特定miRNA的表達(dá)發(fā)揮抑制BMSCs成骨分化的作用。通過抑制其中miR

17、-3077-5p和miR-705的過量表達(dá)，可有效拮抗TNF-α對BMSCs成骨分化的抑制作用，并恢復(fù)OVX BMSCs的成骨分化能力，提示miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　3．TNF-α通過NF-κB信號通路引起miR-3077-5p表達(dá)升高，過量的miR-3077-5p通過直接結(jié)合于Runx2 mRNA3’UTR，從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平降低RUNX2蛋白水平，直接抑制BMSCs成骨分化。