過(guò)載力誘導(dǎo)三維培養(yǎng)成骨細(xì)胞凋亡模型建立及野薔薇苷保護(hù)作用研究.pdf

1、第一部分：過(guò)載力誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡模型的建立
　　目的：通過(guò)探究過(guò)載力持續(xù)時(shí)間及加載周期對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響，建立應(yīng)力性骨折的成骨細(xì)胞凋亡模型。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：將生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為7組：對(duì)照組，每天加載0.5h持續(xù)4d組，每天加載0.5h持續(xù)8d組，每天加載0.5h持續(xù)12d組，每天加載2h持續(xù)4d組，每天加載2h持續(xù)8d組，每天加載2h持續(xù)12d組。
　　2.有限元分析細(xì)胞支架復(fù)合物

2、受力分布情況。
　　3.Hoechst/PI熒光雙染法觀(guān)察支架-細(xì)胞復(fù)合物成骨細(xì)胞凋亡情況。
　　4.采用CCK-8試劑盒檢測(cè)三維培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖活性。
　　5.采用AKP、LDH和Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定成骨細(xì)胞分化、乳酸脫氫酶的外漏量及凋亡標(biāo)志物Caspase-3活性。
　　6.Realtime RT-PCR方法檢測(cè)Caspase-3,9的基因表達(dá)水平。
　　7.Western Blot方法

3、檢測(cè)Caspase-3,9的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1.當(dāng)表觀(guān)應(yīng)變?yōu)?0000με時(shí)，4000με以上應(yīng)變占60％，因此在三維過(guò)載力學(xué)培養(yǎng)環(huán)節(jié)，選擇表觀(guān)應(yīng)變?yōu)?0000με的力學(xué)加載強(qiáng)度。
　　2.在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到，對(duì)照組細(xì)胞偶見(jiàn)紅染細(xì)胞；每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組以及每天加載2h持續(xù)4d組細(xì)胞核形態(tài)與對(duì)照組大致相同，可見(jiàn)少量紅色死亡細(xì)胞；每天加載0.5h持續(xù)12d以及每天加載2h持續(xù)8d和12d組可見(jiàn)

4、凋亡小體并且可見(jiàn)大量紅色死亡細(xì)胞。
　　3.每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組和每天加載2h持續(xù)4d組，CCK-8檢測(cè)OD值顯著升高（P<0.05），而每天加載0.5h，持續(xù)12d組和每天加載2h，持續(xù)8d、12d組，OD值顯著下降（P<0.05）。力學(xué)加載前8d，每天加載0.5h組OD值明顯高于2h組（P<0.05），而加載至12d時(shí)，兩組別無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　4.正常對(duì)照組與0.5h、2h組 AKP表達(dá)量有

5、顯著性差異（P<0.05），0.5h組與2h組之間 AKP表達(dá)量無(wú)顯著性差異（P>0.05）；4d、8d、12d與0d相比 AKP表達(dá)量均升高，4d與8d之間表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而12d比其余組均升高（P<0.05）。
　　5.正常對(duì)照組、0.5h及2h三組LDH外漏量均有顯著性差異（P<0.05），2h組明顯高于正常對(duì)照組和0.5h組；0、4、8、12d四組LDH外漏量均有顯著性差異（P<0.05）。
　　

6、6.與加載0d組相比，除每天加載0.5h，持續(xù)4d組之外，其余各組Caspase-3活性均升高（P<0.05）；持續(xù)加載至第4天時(shí)，每天加載2h組Caspase-3活性顯著高于0.5h組（P<0.05），其余每天兩時(shí)間點(diǎn)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；0.5h組在第8天開(kāi)始 Caspase-3活性顯著升高，在第12天與2h組無(wú)差異。
　　7.與正常對(duì)照組相比，各力學(xué)加載組 caspase-3基因表達(dá)量明顯升高（P<0.05），加

7、載4d時(shí)每天加載2h組caspase-3基因表達(dá)量明顯高于每天加載0.5h組；與正常對(duì)照組相比，各力學(xué)加載組caspase-9基因表達(dá)量明顯升高（P<0.05），加載8d時(shí)每天加載2h組caspase-9基因表達(dá)量明顯高于每天加載0.5h組。
　　8.與正常對(duì)照組相比，模型組加載第8、12天，caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)量明顯升高，且每天加載2h各組蛋白表達(dá)量明顯高于每天加載0.5h組。
　　第二部分：過(guò)載

8、力誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　目的：通過(guò)研究過(guò)載力作用下細(xì)胞膜上鈣離子通道、細(xì)胞外 ATP濃度對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡的影響，探討應(yīng)力性骨折的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為不受力組（正常對(duì)照組（分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基），加入維拉帕米組（分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基）， Hank?s培養(yǎng)基對(duì)照組，Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組），過(guò)載力加載1天組（分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基組，Hank?s培養(yǎng)基

9、組，分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入維拉帕米組，Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組），過(guò)載力加載8天組（分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入維拉帕米組，分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入NEM組）。
　　2.Fluo-4-AM熒光標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。
　　3.ATP活性測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞外ATP活性。
　　4.Realtime RT-PCR方法測(cè)定 Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2基因表達(dá)量。
　　5.Wes

10、tern Blot方法測(cè)定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.每天加載過(guò)載力2h，第一天細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度及細(xì)胞外 ATP含量均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），第二天ATP含量與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05），第三天開(kāi)始 ATP含量顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05）。除第四天外，其余各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著升高（P<0.05），且呈時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。<

11、br>　　2.過(guò)載力作用1d，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和ATP含量顯著升高，加入細(xì)胞胞吐作用抑制劑NEM可以顯著抑制這種效應(yīng)。加入鈣離子通道阻斷劑維拉帕米（細(xì)胞膜上）可以降低細(xì)胞外 ATP含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（P<0.05）。
　　3.過(guò)載力作用第8天，加入NEM對(duì)細(xì)胞外ATP含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；但加入維拉帕米后，細(xì)胞外ATP含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與對(duì)照組相比顯著降低（P<0.05）。

12、r>　　4.過(guò)載力作用第8天，細(xì)胞Caspase-3，Caspase-9以及Bax/Bcl-2比值的蛋白及mRNA表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），維拉帕米可以顯著下調(diào)在過(guò)載力環(huán)境下的細(xì)胞內(nèi)凋亡基因及蛋白的表達(dá)（P<0.05），但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)顯著影響。
　　第三部分：野薔薇苷對(duì)抗過(guò)載力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡及機(jī)制
　　目的：通過(guò)研究過(guò)載力作用下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，探討野薔薇苷對(duì)抗過(guò)載力刺激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制

13、。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：本部分實(shí)驗(yàn)在研究不同濃度野薔薇苷對(duì)過(guò)載力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡模型的作用時(shí)，將生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為6組，分別為：正常對(duì)照組（不加力），過(guò)載力加載模型組，野薔薇苷濃度為1×10-6 mol/L組、1×10-8 mol/L組、1×10-10 mol/L組和1×10-12 mol/L組，均在力學(xué)加載裝置中加載10000με每天2h，持續(xù)8d；在研究野薔薇苷對(duì)抗過(guò)載力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡機(jī)制時(shí)

14、，將生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為4組，分別為正常對(duì)照組，過(guò)載力加載模型組，維拉帕米(1×10-8 mol/L)組，野薔薇苷(1×10-8 mol/L)組，對(duì)照組不做力學(xué)加載，在同樣條件下培養(yǎng)8d，其余3組均在力學(xué)加載裝置中加載10000με每天2h，持續(xù)8d。
　　2.Hoechst/PI熒光雙染法觀(guān)察野薔薇苷抗凋亡作用。
　　3.采用CCK-8方法測(cè)定OD值評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況。
　　4.測(cè)定Caspase-3活性評(píng)

15、價(jià)野薔薇苷抗凋亡基因活化情況。
　　5.測(cè)定LDH外漏量評(píng)價(jià)不同條件下細(xì)胞損傷情況。
　　6.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度評(píng)價(jià)野薔薇苷抗凋亡機(jī)制。
　　7.Realtime RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi) Caspase-9, Caspase-3, Bcl-2和Bax基因表達(dá)情況。
　　8.Western Blot方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi) Caspase-9, Caspase-3, Cyt-C, Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況。<

16、br>　　結(jié)果：
　　1.熒光顯微鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組細(xì)胞偶見(jiàn)紅染細(xì)胞；過(guò)載力加載模型組可見(jiàn)細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞形狀不規(guī)整，出現(xiàn)凋亡小體并且可見(jiàn)大量紅染細(xì)胞；與模型組相比，各加藥組尤其是野薔薇苷1×10-8 mol/L和1×10-10 mol/L組紅染細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　2.與對(duì)照組相比，過(guò)載力加載模型組顯著降低（P<0.05），與模型組相比，各濃度野薔薇苷均能顯著升高細(xì)胞活力（P<0.05），其中1×10-10 mol/L

17、組最高。
　　3.各濃度野薔薇苷組LDH值均顯著低于模型組（P<0.05）。
　　4.與對(duì)照組相比，過(guò)載力加載模型組 Caspase-3活性顯著升高（P<0.05）；加入野薔薇苷可明顯降低Caspase-3活化程度（P<0.05）；其中1×10-8 mol/L和1×10-10 mol/L組Caspase-3活性低于1×10-6 mol/L和1×10-12 mol/L組。
　　5.與對(duì)照組相比，過(guò)載力加載模型組 Casp

18、ase-3和 Caspase-9 mRNA及其蛋白水平明顯升高（P<0.05）；加入野薔薇苷后Caspase-3和Caspase-9 mRNA和蛋白水平明顯降低（P<0.05）。
　　6.與對(duì)照組相比，過(guò)載力加載模型組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高（P<0.05），維拉帕米和野薔薇苷均能阻止細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高（P<0.05）。
　　7.與對(duì)照組相比，過(guò)載力加載模型組Caspase-3, Caspase-9 mRNA表達(dá)水平以及Bax

19、/Bcl-2的比值均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，維拉帕米組除Caspase-9外，其余均顯著性降低（P<0.05）；野薔薇苷組Caspase-3, Caspase-9 mRNA表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2的比值與模型組均顯著性降低（P<0.05）。
　　8.與對(duì)照組相比，過(guò)載力加載模型組細(xì)胞 Caspase-3, Caspase-9, Bax及Cyt-C蛋白水平顯著升高，Bcl-2顯著降低；與模型組相比，維拉帕米組和

20、野薔薇苷組Caspase-3, Caspase-9, Bax及Cyt-C蛋白水平顯著降低， Bcl-2蛋白水平顯著升高。
　　結(jié)論：
　　1.過(guò)載力刺激對(duì)成骨細(xì)胞有“雙向刺激”作用，短期作用能刺激成骨細(xì)胞增殖分化，長(zhǎng)期作用則導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡。
　　2.短期過(guò)載力刺激促進(jìn)細(xì)胞膜上鈣離子通道的開(kāi)放和促進(jìn) ATP向基質(zhì)分泌，共同促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高，長(zhǎng)期過(guò)載力刺激僅作用于細(xì)胞膜上鈣離子通道的開(kāi)放導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載。