銀杏葉片對大鼠苯磺酸氨氯地平藥動學的影響以及乙醇抑制離體大鼠胃收縮反應(yīng)的研究.pdf

1、氨氯地平為第三代二氫吡啶類 Ca2+通道阻滯藥，主要通過阻斷“L-型電位動作”鈣通道。阻滯血管平滑肌細胞外的Ca2+進入細胞內(nèi)，松弛平滑肌，降低心肌收縮力、降低頻率和減慢傳導；此外，氨氯地平可通過提高細胞膜鈣泵活性，從而降低腦漿游離鈣濃度來降低血壓。氨氯地平口服吸收完全，較其他的鈣離子拮抗劑高，但其過程緩慢，在口服后的6~12h才呈現(xiàn)血藥濃度峰值，故氨氯地平具有降壓持續(xù)時間久、血壓峰谷波動較小等特點，可以使氨氯地平具有延遲高血壓發(fā)生并減

2、輕高血壓發(fā)作程度的優(yōu)點。
　　銀杏葉具有藥用價值，可以有效的預(yù)防和治療高血壓、冠心病、心絞痛等心腦血管疾病，廣泛應(yīng)用于臨床。臨床上常見與其他心腦血管藥物聯(lián)合使用，有報道稱，銀杏葉滴丸聯(lián)合苯磺酸氨氯地平可以顯著降低老年高血壓患者血漿sDR4、sDR5的水平，改善老年高血壓患者心肌細胞凋亡。但是從藥代層面評估銀杏葉對氨氯地平的影響尚未見報道。銀杏葉片是否對其藥動學有影響，值得關(guān)注。
　　隨著社會發(fā)展，飲酒成為人類的一種生活習慣，

3、白酒、啤酒、紅酒、香檳等不僅影響了人們的生活，更影響了健康。飲酒時乙醇首先經(jīng)胃吸收入血，其在胃平滑肌中的濃度高于血中的濃度，故對胃腸道的影響更為常見。有研究指出乙醇可直接損害胃粘膜、對消化道平滑肌具有毒性作用等不良反應(yīng)。
　　本課題組建立了大鼠離體胃底、胃體、胃竇、賁門和幽門環(huán)行肌的藥理學實驗方法，并探索了毒蕈堿（M）受體及5-羥色胺（5-HT）受體介導胃平滑肌收縮的藥理學特征。但是，乙醇對大鼠離體胃底、胃體、賁門和幽門環(huán)行肌的作

4、用尚不清楚。
　　第一部分中藥銀杏葉片對苯磺酸氨氯地平在大鼠體內(nèi)藥動學的影響
　　目的：建立檢測苯磺酸氨氯地平代謝產(chǎn)物的HPLC-Orbitrap-Fusion方法，建立測定苯磺酸氨氯地平及其代謝產(chǎn)物的UPLC-MS/MS同時測定方法，通過比較單獨灌胃給予苯磺酸氨氯地平與合用中藥復(fù)方制劑銀杏葉片后大鼠體內(nèi)苯磺酸氨氯地平藥動學參數(shù)的變化，以及苯磺酸氨氯地平代謝產(chǎn)物的變化，探討銀杏葉片對苯磺酸氨氯地平藥動學是否有影響。
　

5、　方法：
　　色譜條件：色譜柱：Xbridge C18色譜柱（100 mm×3 mm，3.5μm）；流動相A：0.1％甲酸水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫；進樣量為2μL；流速：0.6 mL/min；柱溫箱：30 ℃；樣品室溫度：4 ℃；梯度洗脫條件如下：0 min，30%B；3.5 min，50%B；8.5 min，80%B；10 min，90%B；10.5 min，90%B；11 min，30%B；內(nèi)標：哌唑嗪；
　　質(zhì)

6、譜條件：UPLC-MS/MS：離子化方式：電噴霧離子化源（ESI）；檢測方式：正離子檢測；掃描方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；毛細管電壓3 kV；去溶劑氣流速為1000 L/h，源溫度：150 ℃，去溶劑溫度500 ℃；并選擇合適的被測物及內(nèi)標物的檢測離子對、駐留時間、掃描時間、錐孔電壓和碰撞電壓等參數(shù)。
　　HPLC-Orbitrap-Fusion：正、負離子模式全掃描分析條件，正離子噴霧電壓：3.5 kV，負離子噴霧電壓：2.5

7、kV；鞘氣流速：40 Arb，輔助氣流速：12 Arb，尾氣流速1 Arb；離子傳輸管溫度：330 ℃，噴霧器溫度：315 ℃，掃描范圍：100-600 m/z，質(zhì)量分辨率：60000。
　　實驗方法：
　　1.采用HPLC-Orbitrap-Fusion和Mass Frontier7.0軟件分析代謝物的種類及結(jié)構(gòu)。
　　2.采用UPLC-MS/MS分析銀杏葉片對大鼠血漿中苯磺酸氨氯地平藥代動力學的影響。將20只大鼠隨

8、機分為2組，每組10只，對照組灌胃給予2 mL蒸餾水，實驗組灌胃給予銀杏葉片溶液2 mL，每日一次，連續(xù)給藥15天，第16天，每只大鼠灌胃給予苯磺酸氨氯地平2 mL（相當于氨氯地平1 mg/Kg），給藥前12 h禁食，自由飲水，分別于給藥前0.5 h和0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼底靜脈叢取血0.5 mL于肝素抗凝管內(nèi)，離心分離血漿，-20 ℃保存，備用。
　　藥動學參數(shù)處理：測定每只大鼠各取血點的氨氯地

9、平血藥濃度及代謝物的峰面積，采用藥動學軟件WinNonlin對其進行處理得到相關(guān)藥動學參數(shù)。實驗數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示。通過統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism5.0、Graphpad Instart3.0依次將實驗組大鼠與對照組大鼠間主要藥動學參數(shù)進行雙因素方差統(tǒng)計學分析。P值小于0.05則認為兩組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：苯磺酸氨氯地平、哌唑嗪的保留時間分別為3.38 min和1.12 min。血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾

10、苯磺酸氨氯地平和內(nèi)標物質(zhì)出峰及測定。苯磺酸氨氯地平的回歸曲線為Y=0.7887C+0.3851（R2=0.9996），線性范圍為0.15-60 ng/mL，定量下限為0.15 ng/mL。低（0.3 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（30 ng/mL）濃度質(zhì)控樣品溶液的日內(nèi)和日間精密度RSD均低于15%，平均回收率分別為67.67%、70.00%和80.16%，平均基質(zhì)效應(yīng)RSD分別為109%、100%、100%，放置在室溫4 h

11、、24 h與-20° C冷凍儲存30天，血漿樣品均穩(wěn)定。
　　未合用中藥組大鼠苯磺酸氨氯地平的主要藥動學參數(shù)分別為AUC0-t：64.40±25.54 ng/mL·h；AUC0-∞：74.58±29.81 ng/mL·h；t1/2：6.91±1.64 h；Tmax：1.37±0.44 h；Cl：0.02±0.006 L/h/kg；MRT：10.17±0.60；Cmax：5.73±3.16 ng/mL。合用銀杏葉片后，苯磺酸氨氯地平

12、的主要藥動學參數(shù)分別為AUC0-t：33.49±10.70 ng/mL·h；AUC0-∞：36.72±11.06 ng/mL·h；t1/2：6.70±1.07 h；Tmax：2.50±1.30 h；Cl：0.03±0.008 L/h/kg；MRT：10.26±1.43；Cmax：3.29±1.34 ng/mL。將未合用中藥組與合用銀杏葉組大鼠苯磺酸氨氯地平的主要動力學參數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，與未合用中藥組相比，AUC0-t、AUC0

13、-∞和 Cmax明顯減少，Tmax和 Cl明顯的增加，且具有統(tǒng)計學意義。
　　通過HPLC-Orbitrap-Fusion分析以及Mass Frontier7.0軟件對其結(jié)構(gòu)的解析，共確定27種代謝物。在銀杏葉對苯磺酸氨氯地平藥動學影響實驗中，未合用中藥組大鼠血漿樣本中共檢測出9種代謝產(chǎn)物，分別為M2、M3、M5、M7、M14、M15、M16、M18、M23。在合用銀杏葉片組大鼠血漿樣本中共檢測出11種代謝產(chǎn)物，分別為M2、M3、

14、M5、M7、M9、M14、M16、M17、M18、M24、M22。其中代謝物 M15和 M23只存在于未合用中藥組；同樣，代謝物M9、M17、M22、M24只存在于合用銀杏葉片組。
　　結(jié)論：本文所建立的UPLC-MS/MS測定苯磺酸氨氯地平及其代謝物的方法準確，靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于大鼠體內(nèi)血漿中苯磺酸氨氯地平濃度的測定；本文所建立的HPLC-Orbitrap-Fusion方法分辨率高、分析速度快，共檢測出27種代謝產(chǎn)物。適

15、用于大鼠體內(nèi)血漿中苯磺酸氨氯地平代謝物種類的檢測。并且證明，苯磺酸氨氯地平合用銀杏葉片時，后者顯著抑制大鼠體內(nèi)苯磺酸氨氯地平的吸收，加快其清除，且代謝物種類發(fā)生了改變。
　　第二部分乙醇對大鼠胃不同區(qū)域環(huán)行肌M受體和5-HT受體介導收縮反應(yīng)的選擇性抑制作用
　　目的：利用大鼠胃不同區(qū)域環(huán)行肌標本，研究乙醇對M受體和5-HT受體介導的收縮反應(yīng)是否具有選擇性抑制作用。
　　方法：制備大鼠離體胃底、胃體、賁門和幽門環(huán)行肌標本

16、，觀察卡巴膽堿（CCh）或5-羥色胺（5-HT）誘發(fā)的收縮反應(yīng)及乙醇的作用。
　　結(jié)果：0.05‰~0.5‰乙醇不影響CCh誘發(fā)的胃底和賁門環(huán)行肌收縮反應(yīng)以及5-HT誘發(fā)的胃底和胃體環(huán)行肌收縮反應(yīng)。但是0.1‰和0.5‰乙醇顯著抑制了CCh誘發(fā)的胃體環(huán)行肌收縮，Emax值（g）由對照組的12.18±0.33降至10.88±0.41，-LogEC50值由對照組的6.33±0.05降至6.12±0.06。同濃度乙醇顯著抑制了CCh誘發(fā)

17、的幽門環(huán)行肌收縮， Emax值（g）由對照組的2.87±0.15降至2.2±0.13，-LogEC50值由對照組的6.49±0.10降至6.05±0.09。乙醇預(yù)處理賁門環(huán)行肌前，5-HT誘發(fā)賁門環(huán)行肌收縮的Emax值（g）是2.93±0.35，-LogEC50值是6.17±0.21；0.1‰和0.5‰濃度的乙醇顯著抑制了5-HT誘發(fā)的賁門環(huán)行肌收，其Emax值（g）降至2.1±0.30，-LogEC50值未發(fā)生顯著改變。
　　結(jié)