基于銅綠假單胞菌群體感應苯磺酸氨氯地平增加抗菌效應的機制研究.pdf

1、目的：
　　群體感應系統(tǒng)（quorum sensingsystem，QSS）為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）毒力因子表達的重要調控系統(tǒng)。PA群體感應（quorum sensing， QS）的引發(fā)與胞質內(nèi)游離Ca2+濃度（cytosolic free Ca2+ concentration，[Ca2+]i）的升高有關。鈣拮抗劑苯磺酸氨氯地平（amlodipine besylate，AML）可拮抗胞外

2、的Ca2+內(nèi)流，調控PA的[Ca2+]i，從而抑制PA的QS。本研究探討AML的QS抑制活性及其可能機制。
　　方法：
　　1.細菌培養(yǎng)
　　采用平板劃線法活化并分離單一菌落，制備斜面工作管。挑取單一菌落分別于LB、MH、PTSB液體培養(yǎng)基搖床有氧培養(yǎng)。
　　2.分組與給藥
　　設立正常對照組、0.5％二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶劑對照組、鈣離子載體A23187組（1μg·m

3、L-1）及AML組（64、32、16μg·mL-1）。
　　3.測定指標及方法
　　3.1平板菌落計數(shù)法測定PA菌液中的活菌數(shù)，并繪制PA對數(shù)期“活菌數(shù)-OD600”標準曲線，光電比濁法測定PA菌液中的活菌數(shù)（λ=600 nm）
　　3.2光電比濁法測定AML對PA增殖的影響并繪制生長曲線（λ=600 nm）
　　3.3微量肉湯稀釋法測定藥物對 PA的最低抑菌濃度(minimun inhibitory conce

4、ntration，MIC）
　　3.4蛋白水解酶試驗測定PA蛋白水解酶的表達
　　3.5彈性蛋白酶試驗測定PA彈性蛋白酶的表達
　　3.6綠膿毒素試驗測定PA綠膿毒素的表達
　　3.7以Fura-2/AM為Ca2+熒光探針，熒光顯微鏡下觀察探針在PA的負載情況，并用雙波長熒光分光光度法測定PA的[Ca2+]i
　　結果：
　　1.PA對數(shù)期菌液的“活菌數(shù)-OD600”標準曲線為y=0.0797x+0.

5、0094，R2=0.9975
　　2.AML對PA的MIC為512μg·mL-1
　　3.AML（256、128μg·mL-1）可抑制PA的生長（P<0.05）；AML（64、32、16μg·mL-1）對PA的生長無影響，選定AML（64、32、16μg·mL-1）作為實驗濃度
　　4.AML（64、32、16μg·mL-1）可明顯抑制PA綠膿毒素的表達（P<0.01）；可抑制蛋白水解酶和彈性蛋白酶的表達（P<0.05

6、）
　　5.Fura-2/AM可成功負載于PA胞內(nèi)，可用340 nm/380 nm熒光強度比值R（F340nm/F380nm）測定PA[Ca2+]i
　　6.AML（64、32、16μg·mL-1）可降低PA[Ca2+]i（P<0.05）
　　結論：
　　1.AML（64、32、16μg·mL-1）可抑制PA毒力因子的表達
　　2.AML抑制PA毒力表達的作用可能與干擾PA的鈣信號轉導系統(tǒng)調控PA的QS系統(tǒng)