亞麻酸聯(lián)合妥布霉素抗銅綠假單胞菌生物膜形成效應(yīng)的群體感應(yīng)系統(tǒng)機(jī)制研究.pdf

1、背景:自然界中的微生物為人類帶來(lái)了有利同時(shí)又有害的影響。其有利的一面源于人類與微生物界的共生關(guān)系。然而人類一些疾病的發(fā)生使得看似“友善”的微生物成為了會(huì)導(dǎo)致人類許多微生物相關(guān)疾病的條件致病菌。許多細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生生物膜來(lái)抵御不利的生存環(huán)境，這是其中一種防御機(jī)制。生物膜的形成是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，主要取決于當(dāng)環(huán)境信號(hào)刺激細(xì)胞進(jìn)入周期增長(zhǎng)階段的時(shí)間，并且生物膜的形成過(guò)程是由一系列由群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS）支配的基因調(diào)控的。另外，生物膜結(jié)構(gòu)因多糖、蛋白質(zhì)、

2、脂類及胞外DNA等大分子物質(zhì)的存在而被強(qiáng)化，這些物質(zhì)使得微生物能抵抗殺菌藥物。銅綠假單胞菌，一種廣泛存在于自然界中的革蘭陰性的條件致病菌，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一。銅綠假單胞菌有三種相關(guān)的群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS），通過(guò)這些群體感應(yīng)系統(tǒng)，調(diào)控一些毒力因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致銅綠假單胞菌引起人類嚴(yán)重威脅生命的感染，這迫使臨床醫(yī)生大量使用抗生素來(lái)應(yīng)對(duì)這些感染疾病，從而出現(xiàn)了多重耐藥菌株。近年來(lái)，臨床上常用妥布霉素治療由銅綠假單胞菌引起的肺部感染，

3、但是銅綠假單胞菌也產(chǎn)生了對(duì)妥布霉素的抗藥性。目前通過(guò)研發(fā)和使用抗生素來(lái)治療這些感染，盡管大量關(guān)于藥物開發(fā)的研究都致力于減少微生物的耐藥性，但是某些特定抗菌化合物的毒性和耐受性問(wèn)題以及微生物的持續(xù)進(jìn)化給研發(fā)帶來(lái)很多困難，這些迫使研究者關(guān)注和篩選天然植物化學(xué)成分和膳食成分作為抗菌藥物。脂肪酸是人體營(yíng)養(yǎng)的重要組成部分，在人體生長(zhǎng)過(guò)程中扮演十分重要的角色。脂肪酸作為活性物質(zhì)和藥物載體應(yīng)用在制藥行業(yè)，例如脂質(zhì)體制劑以及ω-3脂肪酸在脂質(zhì)異常、糖尿

4、病、癌癥以及抗炎和免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)中的作用，使得人們開始利用以及評(píng)估它在微生物相關(guān)傳染病中的價(jià)值，盡管它有不利的一面，但它可能對(duì)人類健康有更多有益的價(jià)值。在細(xì)菌中，游離脂肪酸通過(guò)多種方式首先作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)菌繁殖受阻或引起類細(xì)胞凋亡樣的殺菌效應(yīng)。這些游離脂肪酸有必需脂肪酸，例如亞油酸和亞麻酸，人體不能合成，但可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和膳食補(bǔ)充劑獲得。亞麻酸連同其ω-3脂肪酸衍生物具有抗多種微生物的能力。所以我們推斷亞麻酸也能具備抗銅綠假單胞菌生物

5、膜，并能提高妥布霉素的藥效。
　　方法:為了證明這一猜想，本研究主要觀察亞麻酸及妥布霉素對(duì)銅綠假單胞菌臨床分離株、環(huán)境分離株和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC27853）的影響。采用結(jié)晶紫染色檢測(cè)生物膜生物量厚度的差異來(lái)評(píng)估生物膜的形成。生物膜越厚，吸收的染液越多，與對(duì)照組相比，如果染色越輕，說(shuō)明是由藥物抑制作用引起的。由于染色法不能區(qū)分附著在生物膜上的活細(xì)胞和死細(xì)胞，我們采用AlarmaBlue法來(lái)測(cè)定生物膜代謝活性，去更好地解釋亞麻酸或

6、妥布霉素的作用。此外，我們用熒光顯微鏡觀察生物膜生物量的變化。由于生物膜的形成由群體感應(yīng)系統(tǒng)控制，我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了選擇性群體感應(yīng)、生物膜和毒力因子相關(guān)基因的表達(dá)水平。另一方面，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的多種毒力因子會(huì)導(dǎo)致宿主組織損傷，因此我們也檢測(cè)了QS相關(guān)毒力因子如群集運(yùn)動(dòng)、綠膿菌素、LasA活性以及偶氮酪蛋白酶的表達(dá)情況，從而確認(rèn)亞麻酸或聯(lián)合妥布霉素是否可以減少這些毒性表型特征的產(chǎn)生從而減輕了銅綠假單胞菌的毒性。
　　結(jié)果

7、:實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞麻酸和妥布霉素對(duì)這些銅綠假單胞菌菌株的中位最小抑菌濃度分別是1.56mg/ml和0.3125mg/ml，其中一株臨床分離株C2對(duì)最小抑菌亞濃度為0.078mg/ml的妥布霉素顯示出抵抗，因此采用此株菌來(lái)研究在不受妥布霉素影響下，最小抑菌亞濃度的亞麻酸對(duì)細(xì)菌的作用效果。在單獨(dú)使用亞麻酸以及聯(lián)合使用妥布霉素會(huì)破壞銅綠假單胞菌生物膜的形成，減少生物膜細(xì)胞的代謝活動(dòng)。在動(dòng)力試驗(yàn)中，與未處理對(duì)照組相比，使用最大藥物劑量能進(jìn)一步阻止

8、群集運(yùn)動(dòng)。亞麻酸也可以減少綠膿菌素的產(chǎn)生以及降低偶氮酪蛋白的活性，并具有劑量依賴性，而妥布霉素不然。同樣也發(fā)現(xiàn)LasA活性受到抑制?；虮磉_(dá)分析結(jié)果也證實(shí)聯(lián)合使用亞麻酸和妥布霉素會(huì)下調(diào)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)、生物膜和毒力因子相關(guān)基因的表達(dá)。藥物相互作用分析結(jié)果也證實(shí)了這種協(xié)同作用。
　　結(jié)論:因此，亞麻酸可以抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成從而可以成為一種潛在的輔助藥物。這種聯(lián)合療法能夠降低妥布霉素的藥用劑量從而減少氨基糖苷類抗生素