熒光假單胞菌生物膜形成特性研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：熒光假單胞菌生物膜形成特性研究</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 環(huán)境科學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p

2、><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本研究利用銀染法觀察了連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中熒光假單胞菌生物被膜生長(zhǎng)的情況，檢測(cè)了紅霉素對(duì)熒光假單胞菌生物被

3、膜合成的抑制，及其與環(huán)丙沙星聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)的協(xié)同抑菌作用。通過(guò)色氨酸法測(cè)定多糖蛋白復(fù)合物（GLX）及最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定，進(jìn)一步得出一定濃度的紅霉素可以顯著抑制細(xì)菌生物被膜多糖蛋白復(fù)合物的合成，并顯著增強(qiáng)環(huán)丙沙星對(duì)生物被膜細(xì)菌的抑菌活性。研究結(jié)果表明，銀染法能夠快速、方便、有效的觀察到生物被膜，紅霉素本身對(duì)熒光假單胞菌并無(wú)抑菌活性但可以抑制GLX的合成，從而能夠提高環(huán)丙沙星對(duì)生物被膜的滲透增強(qiáng)其對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性。</p

4、><p>　　關(guān)鍵詞：銀染法；生物被膜；紅霉素；環(huán)丙沙星</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In this study,first we observed the biofilm formation of the Pseudomonas fluorescens by silver staining, and

5、then we investigated the influence of erythromycin on the production of glycocalyx (GLX) from P.fluorescens biofilms and synergism of antibacterial activities of erythromycin and ciprofloxacin to P.fluorescens in biofilm

6、s. GLX production was measured by using a L-tryptophan method and the minimum inhibitory concentration (MIC) was measured by using microdilution method.It showed that a ce</p><p>　　Key words: silver staining

7、; biofilm; erythromycin;ciprofloxacin </p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料和方法2</b></p><p><b>　　2.1 材

8、料2</b></p><p>　　2.1.1 儀器2</p><p>　　2.1.2 試劑和菌種2</p><p>　　2.1.3 試劑配制2</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法3</p><p>　　2.2.1 滅菌3</p><p>　　2.2.2 倒平板3<

9、;/p><p>　　2.2.3 接種3</p><p>　　2.2.4 搖床培養(yǎng)4</p><p>　　2.2.5 銀染法4</p><p>　　2.2.6 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）4</p><p>　　2.2.7 測(cè)定1/16、1/4MIC紅霉素對(duì)細(xì)菌生物膜的影響5</p>

10、<p>　　2.2.8 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌生物膜的協(xié)同抑菌作用5</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析6</b></p><p>　　3.1 銀染法結(jié)果觀察6</p><p>　　3.2 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌的最低抑菌濃度7</p><p>　　3.3 不同濃度紅霉素對(duì)細(xì)菌生物膜的影響及其對(duì)GL

11、X的抑制作用8</p><p>　　3.4 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌生物膜協(xié)同抑制作用9</p><p><b>　　4 討論10</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)12</b></p><p><b>　　致 謝14</b></p><p

12、><b>　　1 前言</b></p><p>　　長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)細(xì)菌的認(rèn)識(shí)主要通過(guò)浮游的個(gè)體菌，然而近年來(lái)的研究表明，細(xì)菌主要通過(guò)生物膜形式附著于物體表面維系其生存，而不是以浮游形式生長(zhǎng)的[1]。生物膜的許多特性均與其特殊的三維立體空間結(jié)構(gòu)形態(tài)有關(guān)[2]，但對(duì)于細(xì)菌生物膜或者說(shuō)生物膜組織概念的形成及相關(guān)研究也只是在近30年來(lái)才有了重大的突破，所以詳細(xì)了解不同細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)，對(duì)于生

13、物膜研究的深入是必不可少的過(guò)程。</p><p>　　近年來(lái)，利用激光共聚顯微鏡[3]、原子力顯微鏡[4]和電子掃描顯微鏡[5]研究生物膜的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化；通過(guò)雙向電泳技術(shù)[6]和基因芯片[7]來(lái)比較生物膜細(xì)菌和浮游細(xì)菌基因表達(dá)和蛋白組成的區(qū)別等；熒光探針技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)[8]應(yīng)用于細(xì)胞膜的研究中。先進(jìn)生物技術(shù)在生物膜研究的應(yīng)用，使得微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域更加充分。就上述方法操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴而言，結(jié)晶紫染色

14、法[9-10]、銀染法觀察生物膜的方法更值得推廣，如對(duì)于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[11-12]、葡萄球菌（Staphylococcus）[13]、克雷伯桿菌（Klebsiella）[14]等生物被膜的研究。隨著生物膜研究的深入，人類(lèi)將能更好地控制細(xì)菌性感染。</p><p>　　熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種常見(jiàn)的植物根際革蘭氏陰性細(xì)菌，分

15、布廣、數(shù)量多、營(yíng)養(yǎng)需要簡(jiǎn)單、繁殖快、競(jìng)爭(zhēng)定殖力強(qiáng)。其中一些菌株具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和防治病害的作用，有著很好的應(yīng)用前景，但在應(yīng)用上仍有許多問(wèn)題。所以深入了解該類(lèi)菌的形態(tài)、生理特征等生物學(xué)特征具有重要的參考價(jià)值。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的廣泛滲入，通過(guò)對(duì)相關(guān)作用機(jī)制的遺傳性狀進(jìn)行分析，采用遺傳工程加以改良，使得熒光假單胞菌具有更誘人的生防效果。而它的防治效果大致在50%至60%之間，因此需要通過(guò)優(yōu)良菌株的篩選提高其效率[15]，而這些都還有待進(jìn)

16、一步的研究與總結(jié)。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)主要利用銀染法在普通光學(xué)顯微鏡下觀察熒光假單胞菌生物被膜形成狀況，通過(guò)檢測(cè)GLX的濃度來(lái)反映紅霉素對(duì)GLX合成的抑制，同時(shí)測(cè)試了紅霉素與環(huán)丙沙星聯(lián)用來(lái)對(duì)該菌的協(xié)同抑制作用，旨在為控制該菌引起的感染提供部分基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p><b>　

17、　2.1 材料</b></p><p><b>　　2.1.1 儀器</b></p><p>　　熒光學(xué)顯微鏡Loympus BX-51、JY92-2 D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、離心機(jī)（上海離心機(jī)械研究所）、Synergy TMHT超級(jí)多功能酶標(biāo)儀（生泰科技有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-75SII（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)

18、療設(shè)備廠）、THZ-C-1小型搖床（寧波江南儀器廠）等。</p><p>　　2.1.2 試劑和菌種</p><p>　　蛋白胨、瓊脂、色氨酸、紅霉素、環(huán)丙沙星等由上海生工生物有限公司提供，Dextran T-500（美國(guó)Sigrna公司）、MTT（北京索萊寶科技有限公司）等。</p><p>　　5株熒光假單胞菌株由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供，編號(hào)分別

19、為1823、37、55、761、867。</p><p>　　2.1.3 試劑配制</p><p>　　LB液體培養(yǎng)基：用電子天平稱取NaCl 1g，蛋白胨 1g，酵母提取物0.5g，加蒸餾水定容至100mL，并且將pH調(diào)節(jié)至7.0。</p><p>　　LB固體培養(yǎng)基：用電子天平稱取NaCl 1g，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，瓊脂1.5g，加蒸餾水定容至100

20、mL，并且將pH調(diào)節(jié)至7.0。</p><p>　　PBS溶液：用電子天平稱取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.24g，加蒸餾水定容至1L。</p><p>　　0.9%的生理鹽水：用電子天平稱取NaCl 9g，加蒸餾水定容至1000mL。</p><p>　　戊二醛PBS溶液：用電子天平稱取Na2HPO4.1

21、2H2O 21.85g加蒸餾水305mL，NaH2PO4.2H2O 6.09g 加蒸餾水195mL，上述兩溶液互相混合，加50%戊二醛水溶液50mL，加蒸餾水定容至1000mL。</p><p>　　1%對(duì)苯二酚溶液：用電子天平稱取對(duì)苯二酚固體1g，加蒸餾水定容至200mL。</p><p>　　5%硫代硫酸鈉溶液：用電子天平稱取Na2S2O3.5H2O 31.38g，加蒸餾水400mL定

22、容。</p><p>　　飽和氯化鈣溶液：用電子天平稱取氯化鈣固體100g，加蒸餾水100mL定容。</p><p>　　5%硝酸銀溶液：用電子天平稱取硝酸銀固體5g，加蒸餾水100mL定容。</p><p>　　1000μg/mL Dextran T-500：取Dextran T-500固體0.1g，加入100mL蒸餾水，攪拌溶解。</p><

23、p>　　裂解液：取2ml 20mmol/LTris-HCl，50μL 1mmol/L EDTA，1mL 1%Trirton X-100，1mL 1mm PMSF，0.8766g NaCl固體，加蒸餾水定容至100mL。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　2.2.1 滅菌</b></p&g

24、t;<p>　?、賹?shí)驗(yàn)中要用到的錐形瓶、培養(yǎng)皿以及試管等洗滌干凈，自然晾干。②將培養(yǎng)皿一底一蓋為一套，每組12套用報(bào)紙包好。③蓋玻片放入濃硫酸溶液中浸泡，隔夜取出后再放入無(wú)水乙醇中以達(dá)到殺菌滅菌的目的，放入培養(yǎng)皿中包好。④牙簽放入培養(yǎng)皿中用報(bào)紙包好。⑤將試管7支一捆，用報(bào)紙包好。⑥將配制好的LB培養(yǎng)液及上述準(zhǔn)備好的放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌121℃，20min。</p><p><b>　

25、　2.2.2 倒平板</b></p><p>　　將已滅菌并冷卻至60℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿（20mL左右），在無(wú)菌室內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，右手拿著裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無(wú)名指和小指托住皿底，拇指和食指負(fù)責(zé)將皿蓋掀開(kāi)，倒入培養(yǎng)基，待其慢慢覆蓋培養(yǎng)皿底部，將其平放在桌上，冷凝后倒置即成平板。</p><p><b>　　2.2.3 接種</b>

26、;</p><p>　　在無(wú)菌室內(nèi)，接種環(huán)在酒精燈上灼燒至發(fā)紅，觸碰試管壁，冷卻后，蘸取少量菌液，在固體培養(yǎng)基上有規(guī)則的劃線，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。</p><p>　　2.2.4 搖床培養(yǎng)</p><p>　　在無(wú)菌室內(nèi)，用已滅過(guò)菌的牙簽挑取單菌落細(xì)菌，放入已經(jīng)加入5000mL LB液體培養(yǎng)基的試管，在搖床（200r/min，30℃）隔夜培養(yǎng)

27、。</p><p><b>　　2.2.5 銀染法</b></p><p>　　生物膜的制備：在無(wú)菌室內(nèi)，將上步驟隔夜培養(yǎng)含熒光假單胞菌的LB培養(yǎng)基，比濁度調(diào)為0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛?，?00μL菌液加入已加有20mL生理鹽水的培養(yǎng)皿中，并且放入一塊蓋玻片，做好空白對(duì)照，置于30℃恒溫箱培養(yǎng)，每隔兩天換一次生理鹽水，培養(yǎng)7天得到細(xì)菌生物膜[16]。</p>

28、<p>　　將蓋玻片取出，用已經(jīng)滅過(guò)菌的9%的生理鹽水，漂洗多次以去除其他浮游菌，將蓋玻片放在滅過(guò)菌的小培養(yǎng)皿內(nèi)，接著用2.5%戊二醛PBS溶液固定1h，用蒸餾水清洗1min，再用飽和CaCl2溶液結(jié)合15min，繼續(xù)用蒸餾水清洗1min，5%AgNO3溶液反應(yīng)15min，然后1%對(duì)苯二酚溶液顯色2min，蒸餾水清洗1min，最后用5%NaS2O3溶液固定2min，蒸餾水漂洗1min，待蓋玻片干燥后，利用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察

29、，通過(guò)空白作陰性對(duì)照[17-18]。重復(fù)上述步驟，做兩次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照。</p><p>　　注意事項(xiàng)：硝酸銀溶液需要抽濾，不然會(huì)影響染色效果；漂洗過(guò)程應(yīng)輕重適度，尤其是新生物被膜較稀疏，若力度過(guò)大，會(huì)將生物被膜破壞，力度過(guò)小，造成漂洗不徹底，不容易清洗掉浮游菌。</p><p>　　2.2.6 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）</p><p>　　一定量

30、的紅霉素及環(huán)丙沙星加入LB中，取7個(gè)稀釋濃度梯度，倍比稀釋后，每孔300μL加入96孔平板中，最后往孔中加入隔夜培養(yǎng)的菌液5μL，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出[19-20]，酶標(biāo)儀上于600nm處讀取A值，并做好空白對(duì)照，以未見(jiàn)到細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC（即所測(cè)吸光度值接近空白值），從而確定MIC值。重復(fù)上述步驟，做3次實(shí)驗(yàn)取平均值。</p><p>　　2.2.7 測(cè)定1/16、1/4MIC紅霉素對(duì)細(xì)菌生

31、物膜的影響</p><p>　　GLX標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法依照文獻(xiàn)[21]：將配制好的1000μg/mL Dextran T-500的標(biāo)準(zhǔn)樣品倍比稀釋為200、100、50、25和12.5μg/mL 5個(gè)梯度，從中取500μL，滴入裝有4mL無(wú)水乙醇的5mLEP管中，充分混勻后，取出2mL加入2mLEP管中，用離心機(jī)12000r/min離心30min左右，將EP管中的液體倒出，沉淀用100μL的蒸餾水完全溶解后，接

32、著加入硫酸混合液350μL，將EP管放入冰盒中，冰水浴消化10min，再加入1%色氨酸100μL，漩渦2min，使其充分混勻，再將EP管沸水浴中反應(yīng)20min，最后取出后，再在冰水浴中冷卻，取液體300μL加入96孔平板中，在酶標(biāo)儀上于490nm處讀取A值，以A值對(duì)濃度取對(duì)數(shù)做回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　紅霉素對(duì)熒光假單胞菌GLX的抑制作用：將菌液在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)了48h后，已經(jīng)形成生物膜的PV

33、DF膜取出，分別放入對(duì)應(yīng)該菌株0MIC、1/4MIC、1/16MIC的LB培養(yǎng)基中，作用24h后取出，用生理鹽水沖洗幾次，加入1mL的pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上，超聲作用15min，使得生物膜脫落至培養(yǎng)基中，渦旋3min，使其充分混勻，將其調(diào)制成400 nm處透光率為90%（相當(dāng)于2.1×107cfu/mL），接著以3000 r/min離心15min，上清液經(jīng)0.22μm的濾膜過(guò)濾后，取500μL加入裝有

34、4mL100%無(wú)水乙醇的5mL EP管中，以下步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)讀取A值后，利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線求得GLX的濃度。</p><p>　　2.2.8 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌生物膜的協(xié)同抑菌作用</p><p>　　MTT標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[22]：將7.7×108cfu/mL 熒光假單胞菌CGMCC 1.1823稀釋成7.7×108、7.7×107、7.7×1

35、06、7.7×105、7.7×104 cfu/mL，取上述各菌液190μL，分別加入放有20μL MTT試劑的96孔平板中，在37℃的恒溫箱中培養(yǎng)2h后，取出后加入裂解液90μL，待其充分裂解后混勻，在酶標(biāo)儀上于600nm處讀取A值，最后以A值對(duì)菌液濃度取對(duì)數(shù)作直線回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　紅霉素和環(huán)丙沙星對(duì)熒光假單胞菌生物膜的協(xié)同殺菌作用：(1)用LB培養(yǎng)基將紅霉素稀釋成該菌

36、株的0 MIC，1/4 MIC，1/16 MIC三個(gè)不同濃度；環(huán)丙沙星則稀釋成該菌株的0 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC四個(gè)不同濃度，將他們兩者按照不同濃度兩兩組合，分別加入6孔培養(yǎng)板中；(2)把附有細(xì)菌生物膜的PVDF膜經(jīng)生理鹽水沖洗幾次后，放入各孔中，在30℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后，取出PVDF膜，并用生理鹽水沖洗幾次以去除未黏附菌，然后放入加有1mL LB培養(yǎng)基的2mL EP管中，在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上，超聲作用

37、15min，使生物膜上的細(xì)菌剝脫至培養(yǎng)基中，渦旋3min使菌液充分混勻；以下操作同MTT標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)讀取的A值經(jīng)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)菌濃度[23]。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 銀染法結(jié)果觀察</p><p>　　圖1 在普通光學(xué)顯微鏡（400×）觀察到的生物膜形成情況</

38、p><p>　　A1-A5，分別為菌株37培養(yǎng)第1至5天生物被膜形成情況；B1-B5，分別為菌株55培養(yǎng)第1至5天生物被膜形成情況；C1-C5，分別為菌株1823培養(yǎng)第1至5天生物被膜形成情況；D1-D5，分別為菌株761培養(yǎng)第1至5天生物被膜形成情況；E1-E5，分別為菌株867培養(yǎng)第1至5天生物被膜形成情況；F1-F5，分別為培養(yǎng)第1至5天的空白對(duì)照。</p><p>　　以蓋玻片連續(xù)培養(yǎng)

39、，銀染法觀察了5株熒光假單胞菌在5天內(nèi)生物膜形成的情況。從圖1可以清楚地得到：A1-A5，B1-B5，C1-C5分別為37，55，1823第1天到第5天所觀察到生物膜的情況，761和867兩株菌第1天未形成生物膜（D1，E1），在此之后的第2天到第5天里，均觀察到生物膜的生成（D2-D5，E2-E5），圖中呈片狀深染部分，呈棉絮狀的膜樣物就是生物膜；而且隨著時(shí)間的變化，深染面積越來(lái)越大，顏色越來(lái)越深，棉絮狀膜樣物即生物膜也越來(lái)越多，越來(lái)

40、越厚。F1-F5為五天中的空白對(duì)照，銀染后，只能看見(jiàn)散落的黑點(diǎn)或黑斑，基本無(wú)深染的絮狀膜樣物。</p><p>　　3.2 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌的最低抑菌濃度</p><p>　　以96孔板倍比稀釋法檢測(cè)了紅霉素和環(huán)丙沙星對(duì)熒光假單胞菌菌株的最低抑菌濃度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，5株菌對(duì)紅霉素有一定的耐受性，其中867、55、37、1823這4株菌的MIC相同，為640μg/mL，而紅霉素對(duì)7

41、61菌株MIC值是前4株菌的2倍，達(dá)1280μg/mL。5株菌對(duì)環(huán)丙沙星相對(duì)比較敏感，除菌株55的MIC值稍高，達(dá)8.0μg/mL外，其余4株菌的MIC值在0.25-1.0μg/mL范圍內(nèi)。</p><p>　　表1 兩種抗生素對(duì)5株熒光假單胞菌的MIC（μg/mL）</p><p>　　3.3 不同濃度紅霉素對(duì)細(xì)菌生物膜的影響及其對(duì)GLX的抑制作用</p><p&g

42、t;　　以A 值的對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，GLX濃度的對(duì)數(shù)(Y) 為縱坐標(biāo)，得到GLX定量分析回歸方程為Y = 1.261X + 1.64，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9937，線性范圍為200~12. 5μg/mL，最低檢測(cè)濃度為13.2μg/mL。</p><p><b>　　圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖</b></p><p>　　表2 吸光度A-GLX濃度</p>

43、<p>　　圖3 不同紅霉素濃度下所測(cè)GLX濃度</p><p>　　從圖3可以看出：對(duì)于菌株1823、55、37、761和867，隨著紅霉素濃度增加，GLX濃度呈下降趨勢(shì)，體現(xiàn)了紅霉素對(duì)熒光假單胞菌GLX的合成具有一定的抑制作用；不過(guò)，測(cè)試濃度范圍的紅霉素對(duì)菌株55 GLX的合成的影響不夠明顯。</p><p>　　3.4 兩藥物對(duì)熒光假單胞菌生物膜協(xié)同抑制作用</p&

44、gt;<p>　　以A 值的對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，MTT濃度的對(duì)數(shù)(Y) 為縱坐標(biāo)，得MTT定量分析回歸方程為Y = 4.4305X + 8.1292，相關(guān)系數(shù)R2=0.9911。</p><p>　　圖4 MTT標(biāo)準(zhǔn)曲線圖</p><p>　　表3 協(xié)同作用下所測(cè)吸光度A值</p><p>　　表4 協(xié)同作用下所測(cè)細(xì)菌濃度(cfu/mL)<

45、/p><p>　　從上表可以清楚地看出：在不含藥物的情況下，細(xì)菌濃度最大，生長(zhǎng)情況最好；單一地增加紅霉素或環(huán)丙沙星濃度，細(xì)菌濃度都呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)；當(dāng)兩者同時(shí)加入，細(xì)菌濃度則急劇下降，當(dāng)紅霉素濃度達(dá)到1/4MIC，環(huán)丙沙星濃度達(dá)到1MIC時(shí)，細(xì)菌濃度降至最低，遠(yuǎn)低于不含抗生素時(shí)的細(xì)菌濃度。由此可知，紅霉素與環(huán)丙沙星對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用，且效果較為明顯。</p><p><

46、;b>　　4 討論</b></p><p>　　近年來(lái)，針對(duì)細(xì)菌生物膜的研究使微生物學(xué)的發(fā)展邁出了重要一步。生物膜形態(tài)學(xué)定性鑒定方法有多種，主要應(yīng)用掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡等方法觀察鑒定，但均存在操作繁瑣，費(fèi)用昂貴，不易普及，不能滿足臨床實(shí)際需要。因此，尋找一種簡(jiǎn)便快速可靠的生物膜形態(tài)學(xué)觀察方法有重要的臨床意義。本研究采用銀染法對(duì)熒光假單胞菌形成的生物膜進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，熒光假單胞菌培養(yǎng)1至

47、2天就能形成生物膜，顯微鏡下觀察到一大片黑染且呈棉絮狀的膜樣物，培養(yǎng)周期越長(zhǎng)，形成的生物膜就越多，鏡中所觀察到的黑染部分顏色越深，覆蓋面積越廣。由于銀染法價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，并且敏感性好，特異性強(qiáng)，適宜于基層實(shí)驗(yàn)室觀察研究。</p><p>　　生物膜相關(guān)感染廣泛存在于臨床，但其導(dǎo)致的難治性感染的治療仍是臨床有待解決的一大難題。不過(guò)，可以預(yù)見(jiàn)，隨著生物膜研究的深入，人類(lèi)將能更好地控制細(xì)菌性感染。目前大量的研究已經(jīng)

48、證明：某些大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物如紅霉素、阿奇霉素等可破壞細(xì)菌生物膜，并提高環(huán)丙沙星透過(guò)菌膜的能力，紅霉素可明顯增強(qiáng)其抗菌能力，二者具有協(xié)同作用[24-27]。而本研究也驗(yàn)證了紅霉素和環(huán)丙沙星對(duì)熒光假單胞菌生物膜有明顯協(xié)同抑制作用，其中GLX的濃度隨紅霉素濃度的增加而減少，其濃度降低的趨勢(shì)較為明顯，指示了紅霉素能夠抑制GLX的合成，進(jìn)而抑制生物膜的生長(zhǎng)；本研究中，雖然紅霉素對(duì)熒光假單胞菌沒(méi)有直接的抑菌活性，但其增強(qiáng)了環(huán)丙沙星的滲透性，對(duì)其殺滅生

49、物膜中細(xì)菌起增效作用；在相同的環(huán)丙沙星濃度下，其抑菌效果隨著紅霉素濃度的升高而增強(qiáng)；兩種抗生素聯(lián)用后，熒光假單胞菌試驗(yàn)菌株細(xì)菌濃度比單一藥物應(yīng)用時(shí)顯著降低，表明兩者聯(lián)用后增強(qiáng)了抑菌作用；并且，隨著紅霉素濃度和環(huán)丙沙星濃度的增加，其協(xié)同殺菌作用更強(qiáng)?？梢酝普?，兩者合用可能治療由熒光假單胞菌生物膜引起的難治性感染，因此，深入研究中有必要進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，為尋求防治生物膜耐藥性的聯(lián)合藥物治</p><p><

50、b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 李彤,莊輝.細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2002,22(3):343-346.</p><p>　　[2] 唐子圣,朱敏,劉正.變異鏈球菌生物膜結(jié)構(gòu)觀察[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(2):103-106.</p><p>　　[3] 姬亞昆.激光共聚

51、焦掃描顯微鏡及其在牙菌斑生物膜研究中的應(yīng)用[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2006,33(4):281-283.</p><p>　　[4] 王文斌,祁佩時(shí).電子顯微技術(shù)研究生物膜特性[J].工業(yè)安全與環(huán)保,2008, 34(7):15-16</p><p>　　[5] 陳秋云,韓北忠,李春雷.金黃色葡萄球菌生物被膜在不銹鋼表面的形成及其對(duì)二氧化氯的敏感性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,9(

52、4):10-13.</p><p>　　[6] 劉佳,歐陽(yáng)津.雙向電泳檢測(cè)技術(shù)綜述[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(6):43-45. </p><p>　　[7] 尉華,周學(xué)東.牙菌斑生物膜研究方法的新進(jìn)展[J].四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院,2003,15(6):375-376.</p><p>　　[8] 劉靖,陳武.熒光技術(shù)在牙菌斑生物膜研究中的應(yīng)用進(jìn)展[

53、J].口腔生物醫(yī)學(xué),2010,1(2):98-100.</p><p>　　[9] 李燕杰,朱小花,陰冠秀等."不同方法觀察單增李斯特菌生物被膜的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(10):241-246.</p><p>　　[10] 唐歡,黃雪峰,王瑞君等.白色念珠菌芽管的誘導(dǎo)培養(yǎng)及定量檢測(cè)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(3):325-326.</p

54、><p>　　[11] 孔晉亮,劉曉嵐,陳一強(qiáng)等.銀染法觀察銅綠假單胞菌生物被膜變化初探[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,30(1):27-28.</p><p>　　[12] 姚慧琳,劉培明,陸士海等.銀染法鑒定銅綠假單胞菌生物被膜[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2010,35(6):629-630.</p><p>　　[13] 王燕,佟金平,范琳等.銀染法鑒定表皮葡萄球

55、菌生物被膜[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2009, 16(2):548-549.</p><p>　　[14]何平,李乃靜,李勝岐.銀染法鑒定克雷伯桿菌生物被膜[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2003, 22(2):82-85.</p><p>　　[15] 張偉瓊,聶明,肖明.熒光假單胞菌生防機(jī)理的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2007,24(3):9-11.</p><p>　

56、　[16] 佟金平,王鎮(zhèn)山,王燕等.銀染法觀察葡萄球菌生物被膜[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(5):613-615.</p><p>　　[17] 李乃靜,李勝岐,何平等.銀染法鑒定細(xì)菌生物被膜[J].遼寧藥物與臨床,2003,6(1):37-38.</p><p>　　[18] 田靜,李興德,方甜甜等.氨溴索與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的體外抑制作用研究[J].中國(guó)藥

57、房,2010,21(17):1573-1574.</p><p>　　[19] 柴棟,王睿,王文剛等.環(huán)丙沙星脂質(zhì)體對(duì)銅綠假單胞菌的體外抗菌活性[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2010,26(10):740-742.</p><p>　　[20] 晁利剛,谷曉霞,胡功政等.環(huán)丙沙星與粘菌素聯(lián)合對(duì)豬大腸桿菌的體外抗菌研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,21(1):102-104.</p&g

58、t;<p>　　[21] 陳遷,王春,方向群等.羅紅霉素與氟羅沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志,1999,9(10):757-760.</p><p>　　[22] 王睿,陳遷,方向群等.尿激酶或蚓激酶與氟羅沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)菌生物被膜的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1999, 34(9): 662-665</p><p>　　[23] 方向群,劉又寧.亞

59、胺培南聯(lián)合羅紅霉素對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的作用[J].中國(guó)抗生素雜志, 2009,34(11):688-690.</p><p>　　[24] 鄧曉慧,鄭風(fēng)勁,陳蘇婉等.阿奇霉素與環(huán)丙沙星合用對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響[J]. 四川解剖學(xué)雜志, 2008,16(3):15-17.</p><p>　　[25]彭程,肖永紅.大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的影響[J].中國(guó)抗生素雜志

60、,2001,26(4):286-288.</p><p>　　[26]顧曉花,沈策.大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物對(duì)銅綠假單胞菌影響的研究進(jìn)展[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2006,9(3): 200-202.</p><p>　　[27] 王睿,裴斐,柴棟等.克拉霉素對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的影響[J].中國(guó)抗生素雜志2002,27(5):293-296.</p><p><b

61、>　　致 謝</b></p><p>　　本研究能夠順利完成與毛導(dǎo)師的悉心指導(dǎo)及邱師姐的幫助是不可分開(kāi)的，從論文的選題、實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)到論文的完稿，毛老師傾注了大量的心血。毛老師淵博的學(xué)識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度以及誨人不倦的高尚師德都深深的影響著我，使我受益頗多，這也將對(duì)我以后的工作和生活有著很大的幫助。在此，謹(jǐn)向毛老師及邱師姐表示衷心的感謝！</p><p>　　借此機(jī)會(huì)，我要

62、感謝大學(xué)四年里所教育過(guò)我的所有老師們，謝謝你們對(duì)我的教導(dǎo)、關(guān)心和支持，也讓我學(xué)到了很多人生的道理，鍛煉了自己，這一切我都將終生受益。在此，對(duì)他們給予的諸多幫助表示由衷的感謝！還有，我要感謝一直關(guān)心我，幫助我，支持我的家人、朋友和同學(xué)們，是你們給了我堅(jiān)持不懈的勇氣和克服困難的信心。</p><p>　　最后，再次向家人、老師、朋友和同學(xué)們表示由衷的感謝！同時(shí)，向參加論文評(píng)閱及答辯組的老師們，致以真誠(chéng)的感謝，感謝你們