基于CRISPRs的大腸埃希菌分型方法及其與耐藥和毒力關(guān)系.pdf

1、致病大腸埃希菌引起人類或動(dòng)物腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥、血小板減少性紫癜、腦膜炎和敗血癥等疾病，甚至導(dǎo)致死亡，給公眾健康帶來(lái)嚴(yán)重危害?？梢苿?dòng)元件的水平轉(zhuǎn)移在高毒力、強(qiáng)耐藥和新型大腸埃希菌形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CRISPR/Cas系統(tǒng)，廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌中，基于CRISPRs間隔序列的高度多態(tài)性，可作為細(xì)菌分子分型和進(jìn)化的靶標(biāo);CRISPR/Cas系統(tǒng)參與古生菌和細(xì)菌的適應(yīng)性免疫，可特異性抵抗噬菌體感染及質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，從而限

2、制外源遺傳物質(zhì)的水平基因轉(zhuǎn)移。
　　目的：
　　1、分析不同致病類型大腸埃希菌CRISPR/Cas及其側(cè)翼序列的結(jié)構(gòu)特征，探討CRISPRs間隔序列能否作為大腸埃希菌分子分型的靶標(biāo)，評(píng)價(jià)分型效果。
　　2、建立大腸埃希菌CRISPRs的方法，根據(jù)CRISPRs型別預(yù)測(cè)血清型，評(píng)價(jià)其實(shí)際運(yùn)用和預(yù)測(cè)血清型效果。
　　3、分析產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(Shiga toxin-producing E.coli，STEC)的C

3、RISPRs型別與分離時(shí)間、地點(diǎn)的關(guān)系，探討CRISPRs型別在STEC菌株感染暴發(fā)時(shí)的流行病學(xué)意義。
　　4、探討CRISPR/Cas與噬菌體、質(zhì)粒及其介導(dǎo)的可獲得毒力和耐藥基因的關(guān)系，為大腸埃希菌CRISPR/Cas調(diào)控耐藥和毒力的作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、通過(guò)BLAST重復(fù)序列識(shí)別并獲得203株全基因組測(cè)序大腸埃希菌CRISPRs，選取前后2000bp作為CRISPRs候選范圍;通過(guò)CRISPRs

4、finder和BLAST分析CRISPRs的重復(fù)序列和間隔序列，使用ClustalX對(duì)間隔序列、cas和側(cè)翼序列進(jìn)行比對(duì)，使用SeroTypeFinder和MLST獲取菌株的血清型和ST型。
　　2、PCR擴(kuò)增并測(cè)349株大腸埃希菌CRISPRs，CRISPRs finder和BLAST分析大腸埃希菌CRISPRs型別，用血清抗體鑒定菌株血清型。
　　3、分析記錄GenBank中705株鳥(niǎo)槍法測(cè)序STEC菌株的分離時(shí)間和地點(diǎn)

5、，使用SeroTypeFinder和CRISPRs finder獲取血清型和CRISPRs型別。
　　4、利用PHAST獲取203株全基因組測(cè)序大腸埃希菌噬菌體，通過(guò)GenBank獲取其質(zhì)粒信息，通過(guò)VirulenceFinder和ResFinder獲取染色體和質(zhì)粒上的可獲得的毒力和耐藥基因信息?？ǚ綑z驗(yàn)分析CRISPR/Cas與質(zhì)粒和可獲得耐藥基因的分布;Pearson相關(guān)分析CRISPP/Cas與噬菌體和可獲得毒力基因的關(guān)系。

6、
　　結(jié)果：
　　1、CRISPR/Cas在大腸埃希菌中的分布
　　全基因測(cè)序203株大腸埃希菌中，73.4％含有I-E CRISPP/Cas，其中，1株O177∶H21菌株僅有cas2和casl，菌株1303僅有cas2和cas3，12株完全沒(méi)有cas;8.4％含有I-F CRISPR/Cas，均含有完整cas;B7A和Co6114菌株同時(shí)存在I-E和I-F CRISPR/Cas;17.2％僅有CRISPR3-4（無(wú)

7、CRISPR/Cas）。在cas或者CRISPR2中間發(fā)現(xiàn)插入序列IS4，IS66和IS30。I-F CRISPR/Cas和無(wú)CRISPR/Cas的大腸埃希菌均屬于B2種系。
　　2、基于CRISPR1上游序列鑒定大腸埃希菌和志賀菌
　　在大腸埃希菌和志賀菌CRISPR1上游側(cè)翼序列有99％一致性，且有種屬特異性，PCR擴(kuò)增此區(qū)域鑒定大腸埃希菌和志賀菌的靈敏度和特異度均大于91％。
　　3、建立基于CRISPRs大腸埃

8、希菌分型方法
　　CRISPR1，CRISPR2，CRISPR3，CRISPR4和CRISPR3-4的間隔序列數(shù)目的范圍分別是1-25，1-27，4-7，2-22和1-2;獨(dú)特間隔序列數(shù)目分別是339，346，57，66和6，且出現(xiàn)1-72次不等。將I-E CRISPR/Cas，I-F CRISPR/Cas和僅有CRISPR3-4分別命名CTⅠ型，CTⅡ型和CTⅢ型。根據(jù)CRISPRs中間隔序列數(shù)目、構(gòu)成和排列順序進(jìn)行分型。203

9、株大腸埃希菌被分為79個(gè)CT型別(CTⅠ型64個(gè)，CTⅡ型9個(gè)和CTⅢ型6個(gè));76個(gè)血清型和66個(gè)ST型。CRISPRs型別能將相同血清(ST)型STEC菌株分成2類，將O157∶H7(ST11)，O104∶H4(ST678)和O26∶H11(ST21)分別分成CTI4和CTI5，CTI11和CTI12，CTI15和CTI16。
　　擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室菌株的CRISPR1，CRISPR2，CRISPR3，CRISPR4和CRISPR3-

10、4，檢出率分別是81.1％，94.5％，1.4％，1.4％和4.6％;根據(jù)CRISPRs間隔序列分布預(yù)測(cè)O157∶H7準(zhǔn)確率是95.0％。
　　4、建立CRISPRs STEC菌株的分型方法
　　705株（含13種血清型）STEC菌株中，O157∶H7，O26∶H11，O111∶H8菌株構(gòu)成比占前三位，分別是44.0％，16.3％，9.8％;時(shí)間分布顯示STEC菌株于2010年和2011年呈現(xiàn)一個(gè)高峰;地區(qū)分布顯示分離株最多

11、是美國(guó)，其次是荷蘭，分別占50.9％和7.2％。
　　根據(jù)CRISPRs間隔序列可將相同血清型STEC菌株分為不同亞型。O157∶H7的A型、O104∶H4的B型和O111∶H8的A型分別占其菌株的89.0％，87.9％和91.3％;O145∶H28的A型和B型分布?xì)W洲，北美主要是C型，D型，E型和G型;O26∶H11的H型在歐洲，Z型在美國(guó)，而B(niǎo)型和C型在北美和歐洲均有;O69∶H11的A型和B型均分離于美國(guó)，C型分離于荷蘭;O

12、118∶H16的C型均來(lái)源于美國(guó);O45∶H2的A型在北美，B型在中國(guó)。
　　5、CRISPR/Cas與噬菌體、質(zhì)粒和可獲得的毒力、耐藥基因的關(guān)系
　　全基因測(cè)序203株大腸埃希菌中，99.5％(202/203)的大腸埃希菌的染色體中含有噬菌體，數(shù)目為1-22個(gè);相關(guān)分析顯示I-E CRISPR/Cas的間隔序列數(shù)目與噬菌體數(shù)目呈負(fù)相關(guān)線性關(guān)系（r=-0.450，P＜0.001）。
　　56.2％(114/203)大腸

13、埃希菌含質(zhì)粒，含I-E CRISPR/Cas和無(wú)CRISPR/Cas的兩組細(xì)菌的質(zhì)粒分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=6.583，P=0.010)。53株大腸埃希菌含耐藥質(zhì)粒，無(wú)CRISPR/Cas和I-ECRISPR/Cas的兩組細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=19.756，P＜0.001），無(wú)CRISPR/Cas和I-F CRISPR/Cas的兩組細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.017，F(xiàn)isher's精確檢驗(yàn))。
　　9

14、9.5％的大腸埃希菌的染色體中含有可獲得毒力基因，數(shù)目為2-28個(gè);相關(guān)分析顯示I-E CRISPR/Cas間隔序列數(shù)目與染色體上可獲得毒力基因數(shù)目呈負(fù)相關(guān)線性關(guān)系（r=-0.623，P＜0.001）。30.01％(61/203)大腸埃希菌的染色體中含有可獲得的耐藥基因，數(shù)目1-21個(gè);含I-E CRISPR/Cas和I-FCRISPR/Cas兩組細(xì)菌的耐藥基因分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=9.206，P=0.002）。
　　結(jié)論：

15、r>　　1、大腸埃希菌CRISPR/Cas廣泛分布，部分菌株存在cas缺失和IS序列。
　　2、CRISPR1上游序列可用來(lái)鑒定大腸埃希菌和志賀菌。
　　3、建立CRISPRs大腸埃希菌分型方法，具有很好的效果。
　　4、CRISPRs對(duì)相同血清型STEC菌株分型，在一定的程度上可識(shí)別高毒株型別和追溯菌株的分離地區(qū)。
　　5、I-E CRISPR/Cas與噬菌體和毒力基因有關(guān);I-F CRISPR/Cas可能能阻