白藜蘆醇通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性而呈現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng).pdf

1、背景：惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，已成為重要的致死性疾病，上世紀(jì)的發(fā)病率顯著增加。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究取得了巨大進(jìn)步，但是大多數(shù)腫瘤仍不能被治愈?；谀[瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜而使其有效治療舉步維艱。現(xiàn)有的治療方法如化療或放療均具有明顯的毒/副作用，醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者正研究靶向治療，使其藥物僅殺死腫瘤細(xì)胞而不傷害健康細(xì)胞。惡性腫瘤的發(fā)生受環(huán)境因素和遺傳因素共同影響，環(huán)境因素指除遺傳因素之外的所有范圍，而不僅僅指環(huán)境污染。常見(jiàn)的致癌環(huán)境因素包括飲食和肥胖(

2、30-35％)、吸煙(25-30％)、感染(15-20％)、輻射(10％)、精神緊張、缺乏鍛煉和環(huán)境污染物等。大多數(shù)腫瘤發(fā)生與環(huán)境因素相關(guān)，其中部分環(huán)境因素是可由生活方式控制的。因此，其實(shí)癌癥是一種有希望通過(guò)日常調(diào)理、藥物和疫苗來(lái)預(yù)防的疾病。惡性腫瘤的發(fā)生實(shí)際上是細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)失控，并侵入鄰近的身體部位而成癌。在眾多影響腫瘤發(fā)生的因素中，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷及其對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的干擾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用?；罴?xì)胞中許多的

3、氧化反應(yīng)需要酶催化，氧化反應(yīng)即分子間的氫質(zhì)子或電子轉(zhuǎn)移，這類(lèi)代謝反應(yīng)是生命過(guò)程所需能量的主要來(lái)源。地球上絕大多數(shù)復(fù)雜的生命體都依賴(lài)氧而生存，但是氧是一種高活性分子，生物體會(huì)分解氧氣產(chǎn)生包括過(guò)氧化氫(H2O2)、次氯酸(HOCl)和自由基如羥基自由基(·OH)、超氧陰離子（O2-）以及脂質(zhì)過(guò)氧化物等活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，這些代謝產(chǎn)物可以直接或間接地對(duì)核酸、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)造成暫時(shí)或永久性損傷，從而

4、對(duì)生物體自身造成損害。氧化-抗氧化狀態(tài)之間的不平衡造成的氧化損傷與眾多疾病的發(fā)生相關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、急性呼吸窘迫綜合癥、慢性阻塞性肺疾病和哮喘等?；谧陨肀Ｗo(hù)，機(jī)體需要多種類(lèi)型的抗氧化劑以維持氧化代謝的平衡。如谷胱甘肽、維生素C、維生素E以及一些酶類(lèi)，包括過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathi

5、one peroxidase，GPX)等?？寡趸缚杀Ｗo(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，抗氧化酶活性和表達(dá)的失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素。氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)DNA損傷并影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。ROS以多種形式損傷DNA，包括堿基修飾、自由基損害（嘌呤和嘧啶）、DNA斷裂及DNA-蛋白質(zhì)交互連接等。氧化應(yīng)激對(duì)腫瘤發(fā)生與治療的影響被越來(lái)越受到重視。有研究報(bào)道，前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤和其他多種腫瘤都伴有抗氧化酶

6、活性降低或其表達(dá)下調(diào);也有研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤中抗氧化酶水平無(wú)變化，或部分抗氧化酶的表達(dá)水平甚至升高。近期研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者血清中SOD、GPX、CAT、維生素C和維生素E水平均顯著降低;非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者紅細(xì)胞裂解液中的SOD活性較低而GPX活性升高;前列腺癌患者的GPX、CAT和Cu/Zn-SOD活性均降低;口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者的SOD和CAT水平均降低;急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者全血中CAT和SOD

7、活性降低;膀胱癌組織中CAT和SOD活性均顯著低于正常膀胱組織;肺腫瘤組織中總SOD活性升高，CAT活性下降;肺部炎癥會(huì)產(chǎn)生高水平Mn-SOD，但CAT水平降低，二者共同作用可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的H2O2水平上升，因此肺炎將會(huì)為DNA損傷和細(xì)胞惡變提供有利條件，在對(duì)肺癌組織和肺癌A549細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)SOD的水平增加、CAT水平降低、而GPX水平則無(wú)改變。惡性腫瘤是一種典型的多因素疾病，遺傳因素與環(huán)境因素對(duì)腫瘤發(fā)生的影響相互相存。DNA變異

8、可能引起原癌基因活化或抑瘤基因失活，從而使細(xì)胞分化、凋亡失控。基因突變可能是自發(fā)突變或者是暴露于輻射或致癌物質(zhì)所致。抗氧化酶可防止DNA的氧化損傷和延緩或改變細(xì)胞周期。某些病毒如人類(lèi)T淋巴細(xì)胞病毒及某些化學(xué)物質(zhì)，特別是含苯或烷基的藥物等均是重要的致癌因素。已觀察到在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中ROS的產(chǎn)生過(guò)量和/或抗氧化途徑障礙，已發(fā)現(xiàn)在一些類(lèi)型的白血病中抗氧化酶活性缺陷或表達(dá)異常。因此，保持一定水平的抗氧化酶活性對(duì)于預(yù)防惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是至關(guān)

9、重要的。另一方面，靶向抗氧化酶活性可作為腫瘤藥物治療的重要發(fā)展策略，研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)采用GPX和Mn-SOD基因療法可以分別減緩腫瘤生長(zhǎng)速率達(dá)51％和54％，GPX和Mn-SOD基因共轉(zhuǎn)染則可達(dá)到81％的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。此外，研究抗癌藥物對(duì)抗氧化酶活性和表達(dá)水平的影響將加速藥物的作用機(jī)制研究。
　　白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種由植物產(chǎn)生的多酚類(lèi)物質(zhì)(stilbenoid)，化學(xué)名稱(chēng)為3，5，4'-三羥基-反式

10、-二苯乙烯（見(jiàn)下圖），具有可利用的生物學(xué)活性。RSV主要存在于紅葡萄皮、豌豆、堅(jiān)果、藍(lán)莓、桑椹、蔓越莓、姜黃、菠菜、百合等植物組織中，白藜蘆醇苷是RSV的前體，屬于二苯乙烯類(lèi)化合物，是葡萄汁中主要的RSV前體物質(zhì);白藜蘆醇苷經(jīng)米曲霉催化可以形成RSV。事實(shí)上，白藜蘆醇苷是自然界中最豐富的RSV儲(chǔ)存形式。植物中RSV的合成或轉(zhuǎn)化可通過(guò)應(yīng)激因素調(diào)節(jié)，如真菌污染或紫外線(xiàn)輻射。植物中的RSV可作為一種植物抗毒素，能抑制某些植物傳染病的發(fā)生與發(fā)展

11、。研究表明，RSV能顯著增加抗氧化酶SOD、CAT、GPX等和非酶類(lèi)抗氧化物質(zhì)如還原型谷胱甘肽、維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素等的抗氧化作用，并降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平。RSV具有抗衰老、抗腫瘤活性，能夠延緩衰老過(guò)程并最大限度地減少與老化相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生;此外，RSV還具有保護(hù)心臟、抗糖尿病、抗炎癥、抗病毒及保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種作用。已在腫瘤細(xì)胞株、動(dòng)物模型甚至臨床研究中發(fā)現(xiàn)RSV能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展;并在體內(nèi)和體外研究中證實(shí)RSV對(duì)皮膚

12、癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、大腸癌、胰腺癌等具有治療或輔助治療效應(yīng)。機(jī)制研究表明，RSV可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期、抑制血管生成、抑制核因子-κB和環(huán)氧合酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、抑制致癌物的代謝活化、改變與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA表達(dá)模式及抗氧化等而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移或凋亡（見(jiàn)下圖）。近期研究表明，RSV可通過(guò)干擾pAkt(l)/p70S6K信號(hào)途徑而抑制人類(lèi)鼻咽癌(NPC)細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。但目前對(duì)RSV發(fā)揮作用的確切機(jī)制

13、尚未完全了解。本研究即以腫瘤細(xì)胞株為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究RSV經(jīng)抗氧化而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制。
　　本研究采用3種不同的腫瘤細(xì)胞株，即前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞?，F(xiàn)今，這三種腫瘤都被認(rèn)為是最危險(xiǎn)的危及生命的疾病。在全球男性癌癥死亡排名六大癌癥中，前列腺癌排名第二;乳腺癌是女性最常見(jiàn)的浸潤(rùn)性腫瘤;肝癌則是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌。人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞對(duì)于研究

14、中晚期前列腺癌細(xì)胞的生化變化以及評(píng)價(jià)其對(duì)化療藥物的反應(yīng)性很有幫助，PC-3細(xì)胞株是雄激素非依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞，建株于1979年，是從一名62歲的白人男性Ⅳ級(jí)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移樣品中分離得到的;乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞是于1970年從一名69歲的白人女性患者組織樣品中分離得到的，是最常用于研究腫瘤發(fā)生機(jī)制的乳腺癌細(xì)胞;人類(lèi)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞來(lái)自于一名15歲美國(guó)白人男孩的高分化肝癌組織，HepG2細(xì)胞常用于研究肝癌的發(fā)生發(fā)展與治療機(jī)理。

15、為了比較RSV對(duì)這些腫瘤細(xì)胞的作用及其機(jī)制，本研究中我們采用人胚腎細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞作為對(duì)照。本研究同時(shí)采用了幾株人類(lèi)白血病細(xì)胞。人類(lèi)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞來(lái)自于美國(guó)一位患急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的36歲女性，是研究髓樣分化的分子事件的人源細(xì)胞，APL是一種特殊類(lèi)型的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)，HL-60細(xì)胞已

16、成為研究AML的良好模型;K-562細(xì)胞是建株的第一個(gè)具有無(wú)限增殖特性的人類(lèi)白血病細(xì)胞系，主要用作研究慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)的發(fā)生與治療機(jī)理，K-562細(xì)胞具有特征性的基于bcr/abl融合基因的費(fèi)城染色體;KT-1/A3和KT-1/A3R細(xì)胞株是本研究采用的另外兩類(lèi)CML細(xì)胞，其中KT-1/A3細(xì)胞呈現(xiàn)對(duì)干擾素的抗癌效應(yīng)敏感，而KT-1/A3R細(xì)胞則呈現(xiàn)干擾素抗性。研究表明，

17、RSV主要呈現(xiàn)抗氧化效應(yīng)。但是，為什么在一定條件下RSV能保護(hù)正常細(xì)胞而對(duì)腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞毒性仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題。此外，RSV在不同腫瘤中對(duì)抗氧化酶的表達(dá)和活性的影響效果仍然有一些不一致的結(jié)果。
　　目的：采用非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞作為對(duì)照，針對(duì)RSV對(duì)部分實(shí)體瘤及白血病細(xì)胞的作用，揭示RSV對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗氧化酶表達(dá)水平及其活性的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而探討RSV的抗氧化活性對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖/凋亡的影響，剖析RSV的抗氧化/抗腫瘤

18、機(jī)制。
　　方法：采用不同濃度的RSV處理前列腺癌PC-3細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、CML細(xì)胞株(K-562、KT-1/A3、KT-1/A3R)、AML細(xì)胞株HL-60細(xì)胞和非腫瘤人胚腎細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞24-72小時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，分光光度法檢測(cè)抗氧化酶的活性和過(guò)氧化氫(H2O2)的產(chǎn)量，Western印跡定量檢測(cè)抗氧化酶的表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率。采用DMEM培養(yǎng)

19、基培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞，采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞、白血病細(xì)胞和非腫瘤HEK293T細(xì)胞，均加入10％的胎牛血清于37℃和5％濃度的CO2條件下培養(yǎng)。以1.0×105/ml細(xì)胞接種于含有1ml完全培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，其培養(yǎng)基含有不同濃度(0、10、25、50和100μ M)的RSV;培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，富集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞用胰蛋白

20、酶處理，使之與培養(yǎng)皿分離，取等體積的懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物或經(jīng)胰蛋白酶處理的貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，顯微鏡下計(jì)數(shù)未被染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)目。以1000g、5分鐘離心富集培養(yǎng)細(xì)胞，棄上清后用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebuffered saline，PBS)洗滌離心細(xì)胞，然后用200μl放射免疫沉淀分析緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)和1mM苯甲基磺酰氟(phenyl

21、methylsulfonyl fluoride，PMSF)處理細(xì)胞，冰浴30分鐘。將該溶液于12000g離心15分鐘，收集上清蛋白質(zhì)溶液，貯于-20℃?zhèn)溆?。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按體積比1∶1將蛋白質(zhì)溶液與考馬斯亮藍(lán)溶液混合，室溫靜置5分鐘后，以牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，于595nm處測(cè)定待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的吸光度并計(jì)算其蛋白質(zhì)濃度。采用非連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electroph

22、oresis，PAGE)分離蛋白質(zhì)。首先，制備10％的分離膠，取dH2O7.78 ml、40％Acr:Bis4.0ml、pH8.8的1.5M Tris-HCl4.0 ml、10％ SDS160μl、10％ APS80μl和TEMED4.0μl混合均勻，倒入PAGE玻璃槽;將膠在室溫下靜置1小時(shí)后，制備4％的濃縮膠含dH2O3.3 ml、40％ Acr:Bis0.96ml、0.5M Tris-HCl(pH6.8)2.0 ml、10％ SD

23、S80μl、10％ APS40μl和TEMED4.0μl，并倒入玻璃槽中覆蓋分離膠，將梳板插入凝膠中;成膠后，用16μl蛋白質(zhì)溶液與4μl上樣緩沖液混合，95℃加熱10分鐘后上樣;同樣點(diǎn)上已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物，60V電泳30分鐘后，于80-85V電泳90分鐘。將凝膠上分離的蛋白質(zhì)經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后將印跡膜于室溫浸泡在含5％脫脂牛奶的Tris緩沖生理鹽水和吐溫20(Tris-buffered saline andTween2

24、0，TBST)緩沖液中2小時(shí)。印跡膜與第一抗體孵育12小時(shí)后用TBST潤(rùn)洗。然后將印跡膜與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)第二抗體輕輕震蕩孵育2小時(shí)，然后用TBST洗滌三次?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)后，在暗室暴光于X-光片，使用凝膠成像系統(tǒng)（“ImageJ”軟件）對(duì)Western印跡條帶進(jìn)行高密度數(shù)字化處理，對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析。以12000g離心5分鐘收集細(xì)胞，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，用含有1mMEDTA的PBS(pH7.0)勻漿，于4℃、以12000g離

25、心5分鐘后收集細(xì)胞上清液測(cè)定過(guò)氧化氫的含量和酶活性（U/mg蛋白質(zhì)）;采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性;采用鉬酸銨法測(cè)定CAT活性;利用DTNB法測(cè)定GPX活性。經(jīng)RSV誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)后，12000g離心5分鐘收集細(xì)胞，用PBS(pH7.4)洗滌并于70％乙醇中固定過(guò)夜。然后用流式細(xì)胞儀（北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司）分別分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的百分比。對(duì)以上實(shí)驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析和比較檢驗(yàn)，結(jié)果以均

26、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P≤0.05顯示其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:本研究結(jié)果顯示，在濃度小于50μM的RSV處理24小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均無(wú)明顯改變;但是，25μM RSV處理48小時(shí)顯示PC-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制，但MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)未受抑制;用10μM或者25μM的RSV處理72小時(shí)，PC-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制，但濃度低于25μM的RSV對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制效應(yīng);50μM的RSV處理48小時(shí)或7

27、2小時(shí)對(duì)三種細(xì)胞的生長(zhǎng)都有明顯的抑制作用，同時(shí)也抑制非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞的生長(zhǎng);100μM的RSV對(duì)每種細(xì)胞株的生長(zhǎng)都有明顯的抑制作用。25μM的RSV能抑制實(shí)驗(yàn)中所用腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而不影響非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞的生長(zhǎng)，本研究選擇25μM的RSV作為最佳實(shí)驗(yàn)用劑量。對(duì)照組PC-3細(xì)胞中的SOD活性為4.94U/mg蛋白質(zhì)，分別用10μM、25μM和50μM的RSV處理PC-3細(xì)胞72小時(shí)，其SOD活性分別增加43％、8

28、8％和105％;對(duì)照組HepG2細(xì)胞中SOD活性為3.41U/mg蛋白質(zhì)，分別用10μ M、25μM和50μ M的RSV處理72小時(shí)，其SOD活性分別增加55％、63％和87％;對(duì)照組MCF-7細(xì)胞的SOD活性為2.82U/mg蛋白質(zhì)，用濃度為25μM和50μM的RSV處理MCF-7細(xì)胞72小時(shí)，其SOD活性分別增加54％和60％;對(duì)照組HEK293T細(xì)胞中SOD的活性為4.8 U/mg蛋白質(zhì)，低濃度的RSV（10μM或25μM）對(duì)于其

29、SOD活性沒(méi)有影響，但是50μM的RSV可使其活性增加49％。Western印跡分析顯示用濃度為25μM的RSV處理細(xì)胞72小時(shí)，PC-3、HepG2和MCF-7細(xì)胞的SOD2表達(dá)量分別增加3倍、2.5倍和1.5倍，而對(duì)HEK293T細(xì)胞的作用則不明顯;細(xì)胞的處理組和非處理組中的SOD1表達(dá)水平無(wú)明顯差異。PC-3、HepG2、MCF-7和HEK293T細(xì)胞中的CAT活性分別為4.20、4.82、4.08和7.28U/mg蛋白質(zhì)。RSV

30、處理72小時(shí)后各種細(xì)胞株的CAT活性都有一定程度的增加，25μM或50μM的RSV處理HepG2細(xì)胞后其CAT活性分別增加了45％和42％;然而RSV處理對(duì)于其他細(xì)胞的CAT活性無(wú)明顯影響;Western印跡分析顯示用RSV處理的各種細(xì)胞株的CAT蛋白質(zhì)水平均無(wú)明顯改變。HEK293T、PC-3、HepG2和MCF-7細(xì)胞中的GPX活性分別為0.65、0.60、0.74和0.60U/mg蛋白質(zhì);用10-50μM的RSV處理細(xì)胞72小時(shí)，

31、GPX活性及GPX1蛋白質(zhì)水平均無(wú)明顯變化。
　　結(jié)果：RSV能明顯提高腫瘤細(xì)胞的H2O2產(chǎn)生量。用10μM的RSV處理腫瘤細(xì)胞72小時(shí)，其H2O2水平均略微增加，而用25μM的RSV處理PC-3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞72小時(shí)，其H2O2產(chǎn)生量均增加約2.5倍，經(jīng)同樣處理的MCF-7細(xì)胞的H2O2產(chǎn)生量略有增加。與此相反，經(jīng)10-25μM的RSV處理后，HEK293T細(xì)胞的H2O2產(chǎn)生量明顯降低。腫瘤細(xì)胞的過(guò)氧化氫產(chǎn)生量與其SOD活

32、性呈正相關(guān)。流式細(xì)胞分析表明，未經(jīng)RSV處理的PC-3細(xì)胞的凋亡率為4.40％，而經(jīng)RSV處理后，PC-3細(xì)胞的凋亡率提高了近7倍達(dá)29.11％;在未經(jīng)RSV處理的PC-3細(xì)胞培養(yǎng)液中，有50.72％的細(xì)胞處于G1期、39.71％的細(xì)胞處于S期、約9％的細(xì)胞處于G2期;而經(jīng)RSV處理后，處于G1期、S期和G2期的PC-3細(xì)胞比例分別為41.33％、58.66％和0.01％。經(jīng)RSV處理的HepG2細(xì)胞的凋亡率(22.89％)比未處理的H

33、epG2細(xì)胞的凋亡率(3.70％)提高近7倍;未經(jīng)RSV處理的HepG2細(xì)胞處于G1期、S期和G2期的細(xì)胞比例分別為53.5％、39.89％和6.61％;然而，經(jīng)RSV處理的HepG2細(xì)胞處于G1期、S期的細(xì)胞分別為50.52％和49.48％，無(wú)G2期細(xì)胞。然而，RSV對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡率影響甚微;未經(jīng)RSV處理的MCF-7細(xì)胞中53.02％的細(xì)胞處于G1期、42.04％的細(xì)胞處于S期、4.94％的細(xì)胞處于G2期，而經(jīng)RSV處理的M

34、CF-7細(xì)胞處于G1期、S期的細(xì)胞分別為53.73％和46.27％，無(wú)G2期細(xì)胞。25μM的RSV處理HEK293T細(xì)胞72h小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布均無(wú)變化(未處理組的細(xì)胞凋亡率為14.48％，處理組的細(xì)胞凋亡率為14.54％)。RSV對(duì)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈劑量依賴(lài)性，其中對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)最明顯。用低于50μ M的RSV處理24小時(shí)后，HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯改變，但是25μ M的RSV處理HL-60細(xì)胞

35、48小時(shí)則明顯抑制其生長(zhǎng);50μM的RSV處理K-562細(xì)胞72小時(shí)可抑制其生長(zhǎng);100μM的RSV對(duì)于被檢測(cè)的各類(lèi)白血病細(xì)胞都有明顯的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。RSV對(duì)白血病細(xì)胞的部分抗氧化酶表達(dá)水平及其活性具有顯著影響。Western印跡分析顯示用25μM的RSV處理HL-60細(xì)胞72小時(shí)，其SOD2表達(dá)水平升高36％，RSV處理可使K-562細(xì)胞的SOD2表達(dá)水平增加15％。然而，25μM的RSV對(duì)HL-60和K-562細(xì)胞的SOD1、CAT

36、和GPX1的表達(dá)水平均無(wú)明顯影響。未經(jīng)RSV處理的HL-60細(xì)胞的SOD活性為3.3U/mg蛋白質(zhì)，25μM的RSV處理HL-60細(xì)胞72小時(shí)則顯著增加其SOD活性至4.1U/mg蛋白質(zhì)(增加24％);25μM的RSV處理K-562細(xì)胞可使其SOD活性增加11％;RSV幾乎不改變HL-60細(xì)胞和K-562細(xì)胞的GPX活性。流式細(xì)胞分析顯示，RSV可增加白血病細(xì)胞株HL-60和K-562細(xì)胞的凋亡率，并改變其細(xì)胞周期分布。未經(jīng)RSV處理的

37、HL-60細(xì)胞的凋亡百分比為3.89％，25μ M的RSV處理72小時(shí)使HL-60細(xì)胞的凋亡百分比提高5倍(19.76％);未經(jīng)RSV處理的HL-60細(xì)胞中，有35％的細(xì)胞處于G1期、59.2％的細(xì)胞處于S期、5.7％的細(xì)胞處于G2期，而經(jīng)RSV處理的HL-60細(xì)胞處于G1期、S期和G2期的百分比分別為63.2％、36％和0.05％。RSV處理K-562細(xì)胞可使其凋亡率由4.85％升高至7.9％;未經(jīng)RSV處理的K-562細(xì)胞中，50.

38、7％的細(xì)胞處于G1期、49％的細(xì)胞處于S期、不到1％的細(xì)胞處于G2期;而RSV處理的K-562細(xì)胞中，39％的細(xì)胞處于G1期、60％的細(xì)胞處于S期、不到1％的細(xì)胞處于G期(G1/G2)期。RSV明顯影響HL-60細(xì)胞的H2O2產(chǎn)生量。用25μ M或者更高濃度的RSV處理HL-60細(xì)胞明顯增加其H2O2的生成。綜合分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生H2O2依賴(lài)于其SOD活性，并與其細(xì)胞凋亡率相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，RSV對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈劑量依賴(lài)

39、性。RSV在10μM和25μM時(shí)就對(duì)PC-3和HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，但不抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng);50μM的RSV能顯著抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)，但同時(shí)也能抑制HEK293T細(xì)胞生長(zhǎng)。所以25μM的RSV被確定為PC-3和HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的最有效劑量，且此濃度不影響非腫瘤細(xì)胞株HEK293T細(xì)胞的生長(zhǎng)。RSV能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞尤其是PC-3和HepG2細(xì)胞凋亡。RSV抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，且對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效

40、果強(qiáng)于對(duì)K-562、KT-1/A3的和KT-1A3R細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。低濃度RSV可顯著增加PC-3、HepG2和MCF-7細(xì)胞的SOD活性;低濃度RSV幾乎不影響肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的CAT活性及GPX活性;RSV能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)SOD2，但不影響SOD1、CAT及GPX1的表達(dá)。低濃度RSV處理能使PC-3和HepG2細(xì)胞大量產(chǎn)生H2O2，高濃度RSV處理能使MCF-7和HEK293T細(xì)胞大量產(chǎn)生H2O2。細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表

41、達(dá)水平和活性比例失調(diào)可能使過(guò)氧化氫產(chǎn)生量增加，繼而誘導(dǎo)如HepG2和PC-3等腫瘤細(xì)胞凋亡。另一方面，RSV對(duì)非腫瘤細(xì)胞如本研究采用的HEK293T細(xì)胞的抗氧化酶表達(dá)水平和活性?xún)H呈輕微的但成比例的上調(diào)，這可能具有防止正常細(xì)胞惡變的作用;故認(rèn)為RSV可能經(jīng)上調(diào)抗氧化酶表達(dá)和活性，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)，具有預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用。對(duì)白血病細(xì)胞的研究表明，低濃度的RSV即能抑制HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)，但RSV對(duì)CML細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡及抗氧化酶如SOD2

42、活性的調(diào)節(jié)效應(yīng)不明顯;提示RSV可能通過(guò)上調(diào)SOD2表達(dá)水平和活性而使線(xiàn)粒體H2O2產(chǎn)生量增加，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故此認(rèn)為，RSV具有治療AML的潛能。進(jìn)一步需深入研究RSV上調(diào)腫瘤細(xì)胞中抗氧化酶表達(dá)水平和活性的分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以加速RSV的臨床應(yīng)用研究進(jìn)程?？寡趸副磉_(dá)水平的下降或者活性降低可能是細(xì)胞癌變的重要機(jī)制之一。因此，上調(diào)抗氧化酶表達(dá)水平或者提高其酶活性可作為預(yù)防和治療惡性腫瘤的重要策略。研究發(fā)現(xiàn)孕激素能上調(diào)過(guò)氧化氫酶表達(dá)

43、和活性，從而能夠有效預(yù)防乳腺癌;染料木素作為一種抗癌異黃酮，能夠上調(diào)前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145的SOD2和過(guò)氧化氫酶的表達(dá)水平;?；撬峥山?jīng)增加SOD、GPX和CAT表達(dá)水平而有效抑制B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RSV具有抗腫瘤、抗炎癥、降血糖和保護(hù)心血管的作用，主要生物學(xué)效應(yīng)是抗氧化，并能猝滅ROS，避免其對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，其抗氧化機(jī)制類(lèi)似于維生素E。所以，RSV的抗氧化活性能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄