幾丁質酶的活性改良及固定化研究.pdf

1、幾丁質酶是一類催化水解幾丁質及其衍生物中的β-1，4糖苷鍵，產生N-乙酰胺基葡萄糖的糖基水解酶。幾丁質被幾丁質酶水解后，能產生多種不同聚合度的幾丁寡糖。這些幾丁寡糖具有多種生物活性，比如抗細菌和真菌活性，調控機體免疫能力及抗癌等功能。而且，幾丁質酶能破壞植物寄生線蟲腸道和病原真菌細胞壁中的幾丁質成分。因此，幾丁質酶在醫(yī)藥領域、環(huán)保領域和農林業(yè)中具有十分廣泛的應用價值。
　　本研究是針對實驗室先前克隆的幾丁質酶基因pachi，通過易

2、錯PCR技術構建pachi基因的隨機突變庫，采用96深孔板和T7噬菌體結合的高通量篩選技術，以1％可溶性殼聚糖為底物，DNS為指示劑，對隨機突變庫進行篩選。從大約12000個突變株中篩選到一株活性明顯提高的突變體PachiN35D，與野生型進行氨基酸序列比對發(fā)現，突變體的第35位氨基酸殘基由原來的天冬酰胺替換成天冬氨酸。比較分析野生型幾丁質酶Pachi和突變體PachiN35D的酶學性質發(fā)現，對于可溶性殼聚糖底物，突變體PachiN35

3、D的最適溫度為50℃，比野生型Pachi的60℃下降了10℃。野生型Pachi在60℃水浴1h后，還能保持76％的活性，而突變體PachiN35D在55℃水浴1h后幾乎完全喪失活性。分析野生型和突變體的動力學常數，野生型Pachi的Km是36.1mg/mL，突變體PachiN35D的Km是13.3mg/mL，突變體對于可溶性殼聚糖底物的親和力提高了63％;野生型的kcat/Km值是0.37mL/mg/min，而突變體的kcat/Km值是

4、1.14mL/mg/min，表明突變體PachiN35D的催化效率比野生型Pachi提高了2.1倍，并且突變體PachiN35D的比活力是49.9U/mg，相比野生型Pachi的22.3U/mg提高了1.2倍。將幾丁質酶突變體用于秀麗隱桿線蟲的生物測定，突變體的半致死濃度LC50為309.6μg/mL，比野生型的387.3μg/mL降低了20％，因此，突變體的殺線蟲活性提高了20％。
　　以納米SiO2材料為載體，戊二醛為交聯劑，

5、采用共價交聯法對幾丁質酶突變體PachiN35D進行固定化研究。通過傅里葉紅外光譜儀和高倍電鏡掃描分析固定化前后納米SiO2材料的表征變化，檢測到固定化后的納米材料上幾丁質酶上某些特征基團的波峰，且固定化后材料粒徑不變，分布均勻，無明顯聚集現象。固定化酶Im PachiN35D的固定化率高達98％，酶比活力保留率達到70％。比較固定化前后幾丁質酶的酶學性質和動力學常數發(fā)現，固定化酶Im PachiN35D的最適溫度為55℃，相比未固定化

6、PachiN35D的50℃提高了5℃;在55℃水浴處理1 h后，突變體PachiN35D幾乎沒有活性，而固定化酶Im PachiN35D仍保留了56％的活性。分析固定化前后酶的動力學參數發(fā)現，兩者的Km，kcat，kcat/Km幾乎沒有變化，而固定化酶的比活力是未固定化酶的70％，可知固定化酶在提高了熱穩(wěn)定性的同時，還保留了固定化前幾丁質酶的底物親和力，催化效率以及大部分比活力。因此，納米SiO2材料是幾丁質酶固定化載體的最佳選擇之一，