去氫駱駝蓬堿誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞MGC-803及SGC-7901自噬及凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、去氫駱駝蓬堿(harmine, HM)是從維藥駱駝蓬中分離得到的一種β-咔波啉類生物堿，是駱駝蓬抗消化道腫瘤的主要活性成分之一，然而其抗消化道腫瘤的機(jī)制還不清楚。本論文主要研究了去氫駱駝蓬堿對(duì)人胃癌細(xì)胞 MGC-803及 SGC-7901的細(xì)胞毒作用及其分子機(jī)制。
　　本研究以兩株人胃癌細(xì)胞 MGC-803及 SGC-7901作為細(xì)胞模型，用不同濃度HM(0、10、20、40、80μM)分別作用細(xì)胞24 h、48 h及72 h后，

2、在相差顯微鏡下觀察兩株胃癌細(xì)胞的增殖情況及形態(tài)學(xué)改變，并利用MTT法檢測(cè)HM對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。通過對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒用以檢測(cè)細(xì)胞自噬的發(fā)生，Western blot技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(LC3、p62及 Beclin-1)，及其自噬重要調(diào)控通路Akt/mTOR/p70S6K上下游的蛋白表達(dá)情況，從而闡明 HM對(duì)人胃癌細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬現(xiàn)象及機(jī)制。同時(shí)用Annexin V/PI雙染檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生情況，結(jié)合JC-

3、1染色及Western blot技術(shù)，綜合檢測(cè)線粒體膜電位及凋亡相關(guān)蛋白PARP、線粒體途徑相關(guān)蛋白caspase3、caspase9活性形式的生成情況及Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)情況。HM聯(lián)合自噬抑制劑3-MA及BafA1作用胃癌細(xì)胞后觀察細(xì)胞存活狀態(tài)，從而進(jìn)一步了解自噬在HM對(duì)人胃癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用中扮演的角色。通過Akt/mTOR通路抑制劑 LY294002與 HM合用，檢查自噬及凋亡相關(guān)蛋白的變化，更進(jìn)一步確定Akt/mT

4、OR/p70S6K通路在此過程中的作用。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HM以0、10、20、40、80μM分別作用兩株胃癌細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，隨著HM的劑量增加，與空白組比較后，發(fā)現(xiàn)HM組的細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞間的間隙增加，且在高劑量(40、80μM)下，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、碎片，高倍顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)充斥小泡，可能為凋亡小體。MTT結(jié)果顯示，相同劑量 HM作用兩株胃癌細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的抑制胃癌

5、細(xì)胞生長(zhǎng)。Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示，60μM HM作用MGC-803細(xì)胞從6 h延長(zhǎng)到48 h后凋亡率從7.55％增加到54.36%；在SGC-7901細(xì)胞中，凋亡率則從3.63%上升至52.90%，提示HM可致MGC-803及SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PARP的剪切化形式及caspase3、caspase9的活性形式增加，而Bax/Bcl-2比率與HM濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)，提示HM致M

6、GC-803及SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是通過線粒體途徑。JC-1染色結(jié)果顯示，隨著 HM劑量增大，紅綠熒光的比值逐漸降低，表明 HM可影響MGC-803及SGC-7901細(xì)胞的線粒體膜電位，進(jìn)一步提示HM致MGC-803及SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡是通過線粒體途徑。以 GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞 MGC-803及SGC-7901后，40μM HM處理細(xì)胞12 h后可觀察到細(xì)胞中胞漿處有點(diǎn)狀聚集，胞漿型 LC3(LC3-II

7、)生成增多，提示有自噬現(xiàn)象的發(fā)生。從 Western blot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)， LC3-II及 Beclin-1在兩株胃癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)出時(shí)間劑量依賴性增加的趨勢(shì)，而Akt/mTOR/p70S6K調(diào)控通路的mTOR蛋白的磷酸化形式呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴性降低的趨勢(shì)，這種趨勢(shì)同時(shí)出現(xiàn)在其上游蛋白Akt及下游蛋白p70S6K的磷酸化上，提示HM誘導(dǎo) MGC-803及 SGC-7901胃癌細(xì)胞自噬現(xiàn)象可能是由 Akt/mTOR/p70S6K調(diào)控發(fā)生。<

8、br>　　另外，40μM HM聯(lián)合自噬抑制劑3-MA(2.5 mM)及BafA1(100 nM)作用胃癌細(xì)胞后，胃癌細(xì)胞較單獨(dú)使用40μM HM存活率顯著增加，提示自噬在HM對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用中起促細(xì)胞死亡的作用。
　　HM(40μM)聯(lián)合LY294002(PI3K抑制劑)作用胃癌細(xì)胞后，Western blot分析結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ及Beclin-1的水平均有不同程度的提高，自噬底物p62的水平則降低，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白也相