豬傳染性胃腸炎病毒S基因乳腺特異性真核表達(dá)載體構(gòu)建的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Swine Transmissible gastroenteritis,TGE)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬中的豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的高度傳染性腸道疾病,主要臨床癥狀是嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水,各種年齡及品種的豬對該病均易感,尤其對新生仔豬致死率可達(dá)100%.目前,防治該病的最有效手段是接種疫苗.常規(guī)疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗,但它們在一定程度

2、上存在著排毒、散毒、毒力返祖、免疫效果差等缺陷,故免疫效果不夠理想,因此,亟需研制一種高效、安全的基因工程疫苗來從根本上防治TGE.該研究著眼于乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白具有安全、高效、成本低廉的優(yōu)點(diǎn),利用TGEV保護(hù)性抗原編碼蛋白S基因、β-酪蛋白啟動子和表達(dá)載體pEGFP-C1構(gòu)建了TGEV真核表達(dá)質(zhì)粒即基因疫苗.研究內(nèi)容如下:1.該研究根據(jù)TGEV抗原編碼蛋白S基因核酸序列,利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計了5條引物,通過

3、RT-PCR方法直接從含有TGEV的豬腸管組織中分段克隆2 127 bp S1片段和2 450 bp S2片段,經(jīng)酶切鑒定后,分別克隆至pMD-T vector,篩選陽性重組子pMD-S1和pMD-S2,穿刺培養(yǎng)送交測序,核酸序列分析證明與不同毒株相同序列同源性均達(dá)94%以上.S1 3'端和S2 5'端具有81 bp的重疊區(qū),因此以S1和S2的混合物為模板,TS1和TS2為引物,重組PCR擴(kuò)增出4 496 bp S基因全長序列,將其克隆

4、至pGEM-T easy vector,酶切及PCR分析證明S基因全長序列克隆成功.2.根據(jù)表達(dá)載體pEGFP-C1上的多克隆位點(diǎn)及重組質(zhì)粒pG-BBCP中β-酪蛋白啟動子序列,設(shè)計合成引物TS1'和TA2',即在引物TS15'端添加限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ酶切位點(diǎn),引物TA25'端添加限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶切位點(diǎn),利用該對引物從質(zhì)粒pGEM-S上擴(kuò)增S'基因,酶切鑒定PCR回收產(chǎn)物,然后將其克隆到pGEM-T easy vector

5、,酶切鑒定重組質(zhì)粒pGEM-S',Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切pGEM-S'并定向克隆至質(zhì)粒pG-BBCP相應(yīng)位點(diǎn),酶切鑒定重組質(zhì)粒.Sac Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒,回收BCP-S',并在T4 DNA連接酶作用下與pEGFP-C1定向連接,酶切及PCR鑒定,分析表明TGEV乳腺特異性表達(dá)質(zhì)粒(即基因疫苗)構(gòu)建成功.該載體含有強(qiáng)啟動子(人巨細(xì)胞病毒CMV),報告基因(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP),抗性篩選基因(新霉素基因neo<'r