豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白特異性單抗的研制及熒光定量RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、本研究以豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S基因的B、C抗原位點區(qū)為目的基因，設(shè)計一對特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，將目的基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株后，以IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳，得到42KD左右的單一清晰的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)Western-blot檢測證明，重組蛋白具有與豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清反應(yīng)的反應(yīng)原性。

2、　　 將純化的TGEV重組S蛋白作為免疫抗原，對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，效價達(dá)到要求后按常規(guī)方法進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，用間接ELISA對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，對陽性細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆后，最終獲得1株能穩(wěn)定分泌抗重組S蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為3Dll。間接ELISA檢測其細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價為1∶6400。
　　 以豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病

3、毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒(PRV)濃縮作為抗原，與制備的3Dll株雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行間接ELISA檢測，結(jié)果顯示，3Dll株細(xì)胞上清與TGEV反應(yīng)顯著，而與PEDV、PRRSV和PRV不存在交叉反應(yīng)。說明獲得的單抗具有高度特異性。
　　 以感染和未感染TGEV的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物上清作為抗原對獲得的羊抗進(jìn)行間接免疫熒光實驗，結(jié)果在感染TGEV的細(xì)胞中出現(xiàn)強(qiáng)熒光，未感染TGEV的細(xì)胞未出現(xiàn)熒光，試驗結(jié)果表明，制備的單克隆

4、抗體特異性較強(qiáng)，為進(jìn)一步建立豬傳染性胃腸炎的診斷方法奠定了重要的基礎(chǔ)。
　　 本試驗還建立了快速檢測TGEV的熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)TGEV保守的N基因和豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)缺失的部分S基因序列分別設(shè)計合成了兩對引物和兩條TaqMan探針，通過優(yōu)化各項反應(yīng)條件，建立了實時熒光定量RT-PCR方法，該方法能有效地鑒別序列密切相關(guān)的TGEV與PRCV。與常規(guī)RT-PCR試驗相比較，建立的熒光RT-PCR檢測技術(shù)快速、