核桃AFLP銀染技術(shù)體系的建立及指紋圖譜的構(gòu)建.pdf

1、AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)是一種新的DNA分子標(biāo)記技術(shù),具有高效、快捷、穩(wěn)定、可靠的特點.核桃是中國重要的干果樹種,由于長期實生繁殖,后代變異大,造成單產(chǎn)低、商品質(zhì)量混雜.中國是核桃的起源地之一,種質(zhì)資源十分豐富,存在許多特異種質(zhì)資源,但是對中國核桃屬植物的遺傳多樣性的研究非常缺乏.為核桃的品種鑒定和種質(zhì)資源保存提供依據(jù),該研究在建立適合核桃的AFLP銀染技術(shù)體系的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了58份核桃供試樣品的指紋圖譜,并對其遺傳多樣性進行了分

2、析.主要結(jié)果如下:1.確定了適于AFLP分析的核桃基因組DNA提取為改良CTAB法,其提取液成份為:100 mmol/LTris-HCl(pH 8.0),20 mmol/LEDTA,1.4 mol/LNaCl,2％CTAB,3%PVP40,50 mmol/L B-巰基乙醇,10 mmol/L Na2S2O5.粗提后的DNA經(jīng)RNase除去RNA;苯酚-氯仿抽提一次,氯仿-異戊醇抽提兩次,去除蛋白質(zhì),得到了濃度大,基本無降解,蛋白質(zhì)和RN

3、A去除徹底,純度高、質(zhì)量好的核桃基因組DNA.2.通過對內(nèi)切酶用量、酶切時間、連接時間、稀釋倍數(shù)等的研究,建立了適于核桃分析的AFLP銀染技術(shù)體系.在20μL的酶切體系中,含基因組DNA450 ng,NEB Buffer2 2μL,BSA 0.2μL,EcoR Ⅰ(大連寶生物公司)和Mse Ⅰ(NEB公司)各3 U;37℃下酶切4 h;加入接頭后,37℃連接10 h以上(或過夜);連接產(chǎn)物稀釋5倍后進行預(yù)擴增;預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋5倍后再進行

4、選擇性擴增;加10μL Loading buffer,95℃變性10 min,立即冰浴;在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析;銀染法檢測PCR產(chǎn)物.3.從64對引物組合中篩選出10對多態(tài)性高、條帶清晰、分布均勻的引物組合用于材料分析,共擴增出可統(tǒng)計條帶560條,平均每對引物擴增帶數(shù)為56條.其中多態(tài)性條帶527條,占94.11%.根據(jù)材料間的特征帶和差異帶,建立了58份供試材料(46個核桃品種,8個河北核桃類型,4個核桃楸類型)的AF