十字花科黑腐病菌avrXccE1的寄主靶標基因的鑒定.pdf

1、十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，簡稱Xcc)，是一種能在世界范圍內引起十字花科植物產生黑腐病的革蘭氏陰性細菌。研究表明，該菌的無毒基因決定了病菌與寄主植物的相互作用結果。目前己從Xcc8004菌株中預測了9個無毒基因，其中4個已被實驗驗證。本實驗室前期的研究結果表明，含有無毒基因avrXccE1的Xcc8004對中白83的致病力很低，但是該基因的突變體對中白83的致病力顯著提高，實

2、驗證明avrXccE1為無毒基因。生物信息學分析表明，無毒基因avrXccE1演繹的蛋白質不具有核定向信號和DNA結合結構域，具有胞質蛋白的特征。為了鑒定該基因對應的寄主靶標基因，本研究采用蛋白-蛋白相互作用的研究策略，首先通過酵母雙雜交(YeastTwo-Hybrid，YTH)的方法用誘餌從寄主的被侵染cDNA文庫中調取候選互作基因，再用免疫共沉淀技術確認真實的互作基因。
　　 本研究的主要研究結果：(1)通SMART方法，建

3、立了cDNA文庫，文庫轉化率為2.71×106/1μgpGADT7-Rec，重組率為86.4％；(2)將無毒基因avrXccE1構建到雙雜交的BD載體pGBKT7上作為誘餌，對誘餌進行自激活和毒性等相關實驗均達到了酵母雙雜的后續(xù)實驗要求后。用誘餌來篩選構建的中白83cDNA文庫。將雜交液先在SD/-Ade-His-Leu-Trp板上篩選，然后在SD/-Ade-His-Leu-Trp-X-α-Gal板上進行兩次復篩，挑取陽性克隆，對雙鏈c

4、DNA進行序列分析，并對NCBIGenBank數據庫進行BlastX。初步從白菜中鑒定出4蛋白個與AvrXccE1相互作用，分別為泛素共軛連接酶11、硫醇轉甲基酶、磷酸活化酶、幾丁質酶；(3)在已有的3’端的基礎上，對泛素共軛連接酶11基因(ubiquitin-conjuncatingligase11)進行5'RACE(rapidamplificationofcDNAends)實驗獲取該基因的5’端序列，從而得到了全長序列，全長為447