紅肉桃果肉cDNA文庫(kù)構(gòu)建及花青苷合成關(guān)鍵基因鑒定.pdf

1、我國(guó)是桃的發(fā)源地，具有豐富的種質(zhì)資源，按照果肉顏色，桃分為紅肉桃、白肉桃和黃肉桃等。紅肉桃果肉呈血紅色，有血桃之稱，品質(zhì)優(yōu)良，外觀誘人，為我國(guó)桃屬植物中的特色資源。紅肉桃花青苷生物合成受基因表達(dá)調(diào)控，并且具有時(shí)空表達(dá)差異特性。因此，關(guān)于紅肉桃果實(shí)著色相關(guān)的關(guān)鍵基因克隆以及生物信息學(xué)研究對(duì)從分子水平揭示紅肉桃花青苷生物合成的機(jī)理有重要意義。
　　 本研究首先建立高質(zhì)量高豐度的紅肉桃果實(shí)cDNA文庫(kù)，為基因的分離克隆奠定基礎(chǔ);確定紅

2、肉桃果實(shí)花青苷合成相關(guān)的關(guān)鍵酶，克隆出7個(gè)紅肉桃果實(shí)花青苷生物合成的關(guān)鍵功能基因;采用RACE技術(shù)獲得1條花青苷生物合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因MYB轉(zhuǎn)錄因子，具體研究結(jié)果如下:
　　 1.紅肉桃果實(shí)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
　　 以改良的SDS法從紅肉桃品種‘膠州血桃’和‘大把擼’果肉中提取總RNA，分離純化富含PolyA的mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，通過(guò)CHROMASPIN-400柱篩選出其中大于500bp的片段與載體

3、pDNR-LIB連接，最后用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌ElectroMAXDH5α，構(gòu)建了兩個(gè)紅肉桃果肉的cDNA文庫(kù)。經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，‘大把擼’cDNA文庫(kù)庫(kù)容量約為1.20×107cfu/ml，‘膠州血桃’cDNA文庫(kù)庫(kù)容為5.00×107cfu/ml，平均插入片段長(zhǎng)度為1.0kb～2.0kb之間，符合高質(zhì)量文庫(kù)的要求。說(shuō)明文庫(kù)完整有效，可用于大規(guī)模EST序列測(cè)定及數(shù)據(jù)分析。
　　 2.紅肉桃果實(shí)花青苷生物合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的鑒定

4、>　　 利用RT-PCR法克隆花青苷生物合成代謝相關(guān)基因，根據(jù)桃、李、梨和蘋果等果樹上的花青苷生物合成代謝相關(guān)同源基因的高度保守性，設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)并引物。獲得了7個(gè)紅肉桃果實(shí)花青苷生物合成的關(guān)鍵功能基因片段，包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase)，查爾酮合成酶(chalconesynthase)，查爾酮異構(gòu)酶(Chalconeflavononeisomerase)，黃烷酮羥化酶(flavanone3-hy

5、droxylase)，二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol-4-reductaseprotein)，花色素合成酶(Anthocyanidinsynthase)，及無(wú)色花青素雙加氧酶(leucoanthocyanidindioxygenase)。并且也已獲得桃18srRNA基因片段，這為下一步利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)來(lái)分析花青苷合成代謝相關(guān)功能基因在紅肉桃果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期中基因表達(dá)差異打下了基礎(chǔ)。
　　 3.調(diào)節(jié)基因MY

6、B轉(zhuǎn)錄因子的分離
　　 使用SMARTRACEcDNAAmplificationKit，獲得1條花青苷生物合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因MYB轉(zhuǎn)錄因子(PpMYB10，GenBank登錄號(hào)為GU936492)，經(jīng)Blastn同源性檢索結(jié)果表明該基因與其他已報(bào)道的果樹MYB轉(zhuǎn)錄因子同源性分別為:歐洲李(Prunusdomesticasubsp，EU153579)97.4％，酸櫻桃(Prunuscerasus，EU153582)88％，與榅桲和歐