香菇Swollenin的異源轉(zhuǎn)化及T-DNA插入突變體庫(kù)的建立.pdf

1、香菇（Lentinusedodes）是產(chǎn)量?jī)H次于雙孢菇的世界第二大食用菌栽培菌種，是一種重要的藥食兩用真菌，不但具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還具有許多重要的醫(yī)藥保健功能，有著廣闊的國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)，潛力巨大。目前香菇的品種選育技術(shù)還是較多的采取傳統(tǒng)的誘變雜交等育種方法，利用轉(zhuǎn)基因等分子生物學(xué)技術(shù)選育香菇新品種的研究還處于起步階段，同時(shí)香菇的全基因組測(cè)序工作尚未完成，基因功能方面仍未有成熟的研究手段。本論文運(yùn)用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

2、法對(duì)香菇菌株申香10號(hào)進(jìn)行了外源基因的轉(zhuǎn)化，根據(jù)T-DNA隨機(jī)插入的特點(diǎn)建立一個(gè)小規(guī)模的T-DNA插入突變體庫(kù)，采用正反向遺傳學(xué)相結(jié)合的策略對(duì)突變株進(jìn)行基因水平的研究，深入了解基因的功能。
　　 1、以質(zhì)粒載體pCAMBIA1302為骨架構(gòu)建了含有香菇強(qiáng)啟動(dòng)子gpd和擬康氏木霉Swollenin基因的雙元載體pLGS，通過(guò)潮霉素敏感性實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)中初篩的潮霉素濃度為10μg/mL，復(fù)篩時(shí)的濃度為15μg/mL。采用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

3、法對(duì)香菇菌株申香10號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR和點(diǎn)雜交驗(yàn)證swo已經(jīng)整合到香菇基因組中，并且能夠穩(wěn)定遺傳，但是轉(zhuǎn)化率比較低，假陽(yáng)性率高，僅為1個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA。將得到的香菇轉(zhuǎn)化株進(jìn)行栽培試驗(yàn)，轉(zhuǎn)化株1能夠表現(xiàn)出一些優(yōu)良的生物學(xué)性狀，生長(zhǎng)速度達(dá)到0.37cm/d，比原菌株提高了32.14％，產(chǎn)量達(dá)到578.36g/袋，與原菌株相比提高了4.68％，平均單菇重量達(dá)到58.34g。
　　 2、構(gòu)建含有香菇同源gpd啟動(dòng)子的雙元載體pLG

4、F，將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105后，與香菇菌株申香10號(hào)的菌球進(jìn)行共培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化株，建立起具有122個(gè)轉(zhuǎn)化株的小型的T-DNA突變體庫(kù)，并進(jìn)行了分子驗(yàn)證。同時(shí)在不同的轉(zhuǎn)化條件下(農(nóng)桿菌濃度OD660為0.2-0.5，AS濃度為200-300μM，共培養(yǎng)時(shí)間為2-4d)香菇的轉(zhuǎn)化率不同，同PEG轉(zhuǎn)化法相比，轉(zhuǎn)化率明顯提高，達(dá)到18-20％，假陽(yáng)性率低。
　　 3、根據(jù)發(fā)表的真菌三條簡(jiǎn)并引物和T-DNALB

5、與RB區(qū)序列設(shè)計(jì)的特異引物，用簡(jiǎn)并引物與特異引物組合采用TAIL-PCR的方法對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化株T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行克隆，三輪PCR后會(huì)得到0.7-1.0kb大小的片段30個(gè)，其中22個(gè)的轉(zhuǎn)化株和引物組合都能獲得清晰的條帶進(jìn)行測(cè)序，并將得到的序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，其中簡(jiǎn)并引物AD3與LB區(qū)的特異引物組合和其中的一個(gè)轉(zhuǎn)化子可以擴(kuò)增出的0.7kb片段，和樟芝的mnsod基因有一定的同源性，但是相似度不高，僅為4％