動(dòng)物源腸出血性大腸桿菌O157-H7分子流行病學(xué)分析.pdf

1、大腸桿菌O157：H7是一種重要的腸道致病菌，是腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)的一個(gè)主要菌型。近年來，屢屢在國內(nèi)肉制品中檢測到大腸桿菌O157感染。它可導(dǎo)致人急性食物中毒，是國家規(guī)定必檢的病原菌。該菌在世界各地都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行，其感染具有潛在的暴發(fā)流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性、致死性以及抗生素治療可能會(huì)加劇病情等特點(diǎn)，目前已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，所以對(duì)該菌進(jìn)行有效的防控

2、研究成為當(dāng)前亟需解決的問題。為了更好掌握該菌在動(dòng)物群體中的感染情況及其流行菌株的分子特征，為控制其在人畜中的流行提供參考依據(jù)，作者進(jìn)行了以下研究。
　　 1.基于大腸桿菌O157：F17參考菌株的rfbE、fliC、eaeA三個(gè)基因建立三重PCR檢測方法，了解大腸桿菌O157：F17在本地區(qū)的流行情況。對(duì)三重PCR反應(yīng)體系的退火溫度、退火時(shí)間、引物濃度、Mg2+濃度和PCR循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)該方法的敏感性、特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

3、用該方法對(duì)動(dòng)物糞便樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明本方法具有極高的特異性，敏感性可達(dá)到103cfu/mL，并從臨床樣品中分離鑒定到大腸桿菌O157：F17菌株。本研究成功建立了大腸桿菌O157：H7三重PCR檢測方法，并可應(yīng)用于臨床樣品檢測，為大腸桿菌O157：H7的分子流行病學(xué)調(diào)查提供了一種新的檢測方法。
　　 2.利用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法對(duì)來自河南省各地市以及甘肅、廣西、四川等地的2067份樣品進(jìn)行了大腸桿菌O157：F17的分離鑒定

4、。從這些糞樣中分離到6株O157：H7菌株，3株O157：H?菌株，并綜合血清學(xué)方法、生化反應(yīng)、分子生物學(xué)方法對(duì)分離株進(jìn)行了鑒定。由常規(guī)細(xì)菌分離方法分離到的大腸桿菌O157菌株與血清學(xué)方法、生化反應(yīng)、PCR鑒定結(jié)果相一致，屬于大腸桿菌O157菌株。雖然從樣品中分離到的OI57菌株陽性率很低，而目前大腸桿菌O157也沒有出現(xiàn)大的爆發(fā)，但是在臨床樣品中畢竟有該菌的存在，說明目前該菌仍然存在潛在的暴發(fā)危險(xiǎn)，仍然需要加強(qiáng)對(duì)該菌的監(jiān)控和預(yù)警。

5、r>　　 3.為了更好地了解大腸桿菌O157各分離株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并進(jìn)一步確定大腸桿菌O157分離株的進(jìn)化地位及其溯源。本研究以大腸桿菌O157：H7分離株利O157：H?分離株為研究對(duì)象，根據(jù)GenBank上登錄的相關(guān)序列，針對(duì)大腸桿菌的三個(gè)管家基因16SrRNA、gyrB、recA以及兩個(gè)志賀毒素基因stx1、stx2設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、序列測定，并且通過構(gòu)建進(jìn)化樹來進(jìn)行系統(tǒng)演化分析。結(jié)果表明，大腸桿菌O157分

6、離株與陽性參考菌株在基于三個(gè)管家基因所建立的進(jìn)化樹上種系發(fā)育關(guān)系非常接近；對(duì)毒力基因分析發(fā)現(xiàn)，2株O157：H?菌株不含stx2基因，1株O157：H?菌株不含stx基因；通過進(jìn)化樹進(jìn)行溯源分析，可推測出各分離株的大致起源，本研究為大腸桿菌O157分子流行病學(xué)研究和快速溯源提供了參考。
　　 4.根據(jù)Genbank公布的大腸桿菌O157：H7rfbE和fliC基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，并對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測大腸

7、桿菌O157：H7的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，并對(duì)該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。應(yīng)用該二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)所有大腸桿菌O157：H7菌株的檢測結(jié)果均為陽性，對(duì)沙門菌、志賀菌、枸櫞酸桿菌、巴氏桿菌、腸球菌、鏈球菌1型、鏈球菌2型等菌株則為陰性；該方法檢測的靈敏度可達(dá)2.95×100copies/μL，比普通PCR的靈敏度高103倍；定量檢測的批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于2％；本研究建立的熒光定量PCR方法為大腸桿菌O15

8、7：H7的臨床診斷，以及食品安全檢測提供了新的鑒定方法，同時(shí)也為食源性疾病的分子流行病學(xué)調(diào)查提供新的檢測手段。
　　 5.應(yīng)用多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)(MLVA)對(duì)大腸桿菌O157：H7進(jìn)行了分子流行病學(xué)分析，初步研究了大腸桿菌O157：H7分離株的基因型，并對(duì)MINA分型方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究采用核酸提取、PCR和瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)，結(jié)合BioNumerics(Version5.0)軟件，利用上述方法對(duì)O157：H