FST轉(zhuǎn)基因羊的檢測(cè).pdf

1、1980年科學(xué)家通過動(dòng)物遺傳修飾技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物----轉(zhuǎn)基因小鼠。到目前為止，科學(xué)家通過不同基因修飾方法獲得各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物種。近幾年，我國在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究領(lǐng)域也有了突破性進(jìn)展，這些成果為動(dòng)物育種和研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室于2011年后也陸續(xù)獲得了一批卵泡抑制素FST基因轉(zhuǎn)基因克隆羊。我們對(duì)得到的部分FST轉(zhuǎn)基因蒙古羊(NO.14，NO.17，NO.18)和轉(zhuǎn)基因山羊(NO.21)通過PCR、southern blot、we

2、stern blot、實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)、肌肉組織切片和血液生化分析等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)分析。研究FST基因的轉(zhuǎn)入對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)、個(gè)體肌肉發(fā)育及動(dòng)物健康的影響。主要研究內(nèi)容包括：
　?、磐庠椿蛘锨闆r的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用Southern blot和PCR技術(shù)分別對(duì)轉(zhuǎn)基因羊外源基因整合情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:被檢測(cè)的四只羊基因組中均有外源基因整合，并且外源質(zhì)粒的多個(gè)位點(diǎn)（SP啟動(dòng)子、α-actin啟動(dòng)子、FST、CMV啟動(dòng)子、DsR

3、ed和新霉素抗性基因）均已整合到了轉(zhuǎn)基因羊的基因組中。
　?、仆庠椿蚩截悢?shù)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)以glucagon作為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:log5N=-0.415△Ct+0.0194(R2=0.9911)（△Ct為外源基因Ct與內(nèi)參基因Ct的差，N代表拷貝數(shù)），計(jì)算得到NO.14、NO.17、NO.18和NO.21轉(zhuǎn)基因羊中外源基因的拷貝數(shù)分別為4、10、3和1。
　

4、　⑶FST基因的表達(dá)分析。利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢測(cè)FST基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明:與普通蒙古羊，山羊相比，在NO.14、NO.17、NO.18和NO.21轉(zhuǎn)基因羊的肌肉組織中FST的相對(duì)表達(dá)量分別為1.125、1.021、1.959和1.157倍，MSTN的相對(duì)表達(dá)量分別是1.804、2.235、1.495和1.102倍，BMP4的相對(duì)表達(dá)量分別為0.504、0.135、0.165和0.265倍;與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因羊NO

5、.14、NO.17、NO.18和NO.21的皮膚組織中FST的相對(duì)表達(dá)量分別為1.101、1.089、1.156和0.868倍，MSTN的相對(duì)表達(dá)量分別是1.172、1.134、1.203和1.230倍，BMP4的相對(duì)表達(dá)量分別為0.978、1.021、1.142和0.451倍。選取GAPDH作為內(nèi)參，利用western blot技術(shù)檢測(cè)FST和MSTN蛋白的相對(duì)表達(dá)量。western blot結(jié)果顯示:與普通綿羊相比，轉(zhuǎn)基因綿羊NO.

6、14、NO.17、NO.18肌肉組織中FST蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.05、1.13和1.05倍，轉(zhuǎn)基因綿羊NO.14、NO.17、NO.18肌肉組織中MSTN蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.81、0.70和0.76倍。與普通山羊相比，轉(zhuǎn)基因山羊NO.21肌肉組織中FST蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.72倍，轉(zhuǎn)基因山羊NO.21肌肉組織中MSTN蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.69倍。
　?、菷ST轉(zhuǎn)基因羊個(gè)體水平檢測(cè)分析。對(duì)三只轉(zhuǎn)基因蒙古羊(NO.14，NO.

7、17，NO.18)和一只轉(zhuǎn)基因山羊(NO.21)肌肉做石蠟切片，并進(jìn)行HE染色，分析其肌纖維密度和肌纖維直徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因蒙古羊NO.14、NO.17、NO.18的肌纖維密度分別為246根/毫米2、235根/毫米2、233根/毫米2，普通蒙古羊的肌纖維密度為213根/毫米2，轉(zhuǎn)基因蒙古羊的肌纖維密度大于普通蒙古羊?qū)φ?轉(zhuǎn)基因山羊NO.21的肌纖維密度為271根/毫米2，也大于普通山羊的肌纖維密度（224根/毫米2）。轉(zhuǎn)基因蒙古羊NO

8、.14、NO.17、NO.18肌纖維直徑分別為55.38微米、64.32微米、58.93微米，普通蒙古羊的肌纖維直徑為49.06微米，轉(zhuǎn)基因山羊肌纖維直徑大于普通山羊?qū)φ?轉(zhuǎn)基因山羊NO.21肌纖維直徑為62.58微米，大于普通山羊的肌纖維直徑(50.69微米)。另外，對(duì)轉(zhuǎn)基因羊進(jìn)行血液生化分析，包括肝功、腎功、血糖和血脂分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因蒙古羊和轉(zhuǎn)基因山羊的各項(xiàng)指標(biāo)均與普通蒙古羊和普通山羊無明顯差異。結(jié)果顯示，目的基因FST的高表