抗乳腺癌人源單鏈抗體CM1-scFv的表達與活性分析.pdf

1、乳腺癌是婦女發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，外科手術、放射與藥物治療均為乳腺癌的重要治療手段。藥物療法是乳腺癌綜合治療的重要組成部分。單克隆抗體有高度特異性，探索乳腺癌的抗體靶向治療有重要的臨床價值。由于人體對鼠源單克隆抗體能產生人抗鼠抗體反應(HAMA)，人源單克隆抗體成為單克隆抗體應用于臨床治療的一個關鍵因素。 1991年中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所王樹蕙教授利用轉移性乳腺癌患者腋窩淋巴結淋巴細胞與人鼠雜合骨髓瘤SMH-D33融合

2、，篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗乳腺癌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，CM1。據報道該抗體重鏈類型為人μ鏈，輕鏈類型為鼠κ鏈。免疫組化、裸鼠移植瘤放射免疫顯像顯示其有較強特異性。與平陽霉素構建的化學偶聯物有高于游離平陽霉素的抑瘤率，表明CM1單克隆抗體有可能發(fā)展成為抗腫瘤藥物的載體將藥物導向腫瘤組織。 力達霉素(Lidamycin，LDM)是本研究室從一株放線菌(Streptomycesglobisporussp.C-1027)代謝產物中獲得

3、的對腫瘤細胞有強烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素。力達霉素的分子由發(fā)色團和輔基蛋白組成，發(fā)色團具有細胞殺傷活性，輔基蛋白起保護穩(wěn)定發(fā)色團的作用，二者可拆分與重建。重建的力達霉素與天然狀態(tài)力達霉素具有相同高度的活性。 本研究鑒定了抗體輕鏈來源，分別構建了CM1單鏈抗體和單鏈抗體力達蛋白融合蛋白的原核表達載體，pET-scFv，pET-scFv-LDP。pET-scFv轉化大腸桿菌E.coliBL21starTM(DE3)，經誘導

4、，純化，復性得到純化的scFv，研究其免疫活性，探討進一步開發(fā)融合蛋白的價值。 一、抗乳腺癌人源單鏈抗體CM1-scFv的表達、純化及活性分析采用有限稀釋法對雜交瘤細胞株CM1進行亞克隆化培養(yǎng)，取上清經間接ELISA檢測出抗體高分泌亞克隆4A7和4A8。擴大培養(yǎng)4A7和4A8，收集上清經硫酸胺沉淀濃縮后進行免疫雙擴散分析，證明CM1單克隆抗體的輕鏈來源于小鼠，含人輕鏈基因的染色體已經丟失，從雜交瘤中克隆出人源化輕鏈基因的可能性小

5、。于是從已有的含有該單克隆抗體重鏈輕鏈可變區(qū)的質粒出發(fā)構建含組氨酸標簽肽(Histag)的單鏈抗體。 經SOE-PCR克隆出VH-Linker-VL形式的單鏈抗體基因，Linker由3個GGGGS串聯組成。將PCR產物插入pGEM-T質粒進行序列測定。取序列準確無誤的克隆進行NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，釋放出的片段與同樣雙酶切過的pET-30a(+)連接，轉化E.coliDH5α。篩選出的重組克隆經測序證明無誤后轉化表達宿主菌E.

6、coliBL21star(DE3)，IPTG誘導后收集菌體，經SDS-PAGE分析證明有約27kDa外源蛋白的表達，Western-blot結果證實在27kDa的誘導表達條帶是帶有Histag標簽肽序列的重組單鏈抗體。 定位分析表明蛋白以不可溶包涵體形式存在于細胞質。經SDS-PAGE分析，1L菌液誘導后能產生約200mg含重組單鏈抗體的包涵體。用含6M尿素的變性液溶解包涵體，利用基于固定化Ni離子親和層析柱，對單鏈抗體CM1-

7、scFv進行了純化得到約6mg可溶性變性產物。采用分步透析的方法對蛋白進行復性，復性過程中出現了白色絮狀蛋白沉淀，超濾濃縮上清后得到濃度280μg/ml的可溶蛋白3ml。 間接ELISA法測定單鏈抗體CM1-scFv與CAMA細胞的親和力常數為2.5×10-6M。ELISA法測定CM1-scFv與人胰腺癌PANC1細胞，人肝癌Bel-7402細胞人結腸癌HCT-8細胞結合活性實驗表明單鏈抗體與Bel-7402有較高的結合活性，與

8、其他腫瘤細胞結合活性低。Western-blot結果表明CAMA細胞HER-2表達水平不高，與人乳腺癌MCF-7細胞表達水平相似。采用ELISA法測定CM1-scFv與三種人乳腺癌細胞系的免疫反應性。結果顯示，單鏈抗體并沒有對HER-2表達量高的SKBr-3細胞顯示出高于MCF-7，CAMA細胞的結合活性，說明CM1單克隆抗體靶抗原是HER-2的可能性不大。 從實驗結果分析CM1-scFv的優(yōu)點是含有一條人源的重鏈可變區(qū)，不足之

9、處是復性難度大，容易形成沉淀降低了活性純化蛋白的產量。免疫活性分析結果不提示CM1-scFv有很高的親和力，這個可能與蛋白復性不理想有關。 二、抗乳腺癌人源單鏈抗體力達蛋白CM1-scFv-LDP融合基因的克隆和表達載體的構建 CM1-scFv復性困難可能與分子間疏水鍵相互作用形成多分子復合物有關，于是考慮將其以融合蛋白形式表達，利用LDP的空間位阻保護重鏈輕鏈可變區(qū)的疏水鍵，抑制分子間相互作用。一方面有可能提高蛋白復性

10、效率，另一方面與力達霉素發(fā)色團分子重建，使融合蛋白在有靶向性的同時還具有細胞毒性。 從第一部分構建的含有CM1-scFv基因的pT-scFv和含有LDP基因的pET-VHLDP出發(fā)，PCR克隆出添加了Spacer肽，具有序列重疊區(qū)的CM1-scFv、LDP基因，通過重組PCR成功構建融合基因scFv-Spacer-LDP。PCR產物插入pGEM-T載體，測序結果無誤。進行NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，釋放出的片段與同樣雙酶切過的pE

11、T-30a(+)連接，轉化E.coliDH5α，挑取重組克隆得到重組表達質粒pET-scFv-LDP。測序結果顯示融合蛋白的基因序列，在T7lac啟動子的控制下，6個連續(xù)的組氨酸插入到融合蛋白的C-末端，緊鄰終止密碼子。CM1-scFv-LDP融合基因的克隆和表達載體的構建為進一步表達融合蛋白奠定了基礎。 綜上所述，CM1單克隆抗體的人源特性使其具備了發(fā)展成為治療性抗體的潛力。本研究證明CM1單克隆抗體的重鏈為人源性，輕鏈為鼠源