恩度聯(lián)合mut1抗原特異DC-T細(xì)胞對Lewis肺癌小鼠的抗腫瘤效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移都與腫瘤的的血管新生密不可分，因此抑制腫瘤的血管新生是控制腫瘤生長的新熱點(diǎn)。重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度，Endostar)是通過抑制血管生長起抗腫瘤作用的一種藥物。研究證實(shí)單獨(dú)應(yīng)用抗血管新生藥物不能帶來長期的生存獲益，而聯(lián)合細(xì)胞免疫治療可能獲得持續(xù)性的腫瘤消退，這提示抗血管新生藥物與細(xì)胞免疫治療有協(xié)同效應(yīng)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antige

2、n-presenting cells，APCs)，在調(diào)控機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要的作用，負(fù)載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞是近年來被廣泛研究生物治療之一。本實(shí)驗(yàn)通過C57BL/6小鼠Lewis肺癌荷瘤模型，研究恩度聯(lián)合負(fù)載mut1抗原特異的DC-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)及對腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫網(wǎng)絡(luò)的影響，進(jìn)一步明確恩度聯(lián)合細(xì)胞免疫治療的抗腫瘤效應(yīng)，從而為開展抗血管新生的分子靶向治療與細(xì)胞免疫治療的聯(lián)合提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：

3、>　　1.培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞:顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量，及時(shí)換液和傳代，待細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)期后，用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.制備負(fù)載mut1抗原多肽的DC-T細(xì)胞:分離及培養(yǎng)小鼠脾T淋巴細(xì)胞，分離及培養(yǎng)小鼠來源的樹突狀細(xì)胞，負(fù)載mut1抗原多肽的樹突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)制備mut1抗原特異性的DC-T細(xì)胞。
　　3.構(gòu)建C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下種植瘤模型并分組:將C57BL/6小鼠荷瘤后隨機(jī)分為A組（PBS對照

4、組）、B組（DC-T組）及C組（DC-T+恩度組）。荷瘤后第7天開始給予治療干預(yù):A組給予尾靜脈注射PBS溶液，B組及C組給予尾靜脈輸注負(fù)載mut1抗原肽DC-T細(xì)胞，C組給予尾靜脈注射恩度（重組人血管內(nèi)皮抑素）。
　　4.腫瘤生長情況及抑瘤率的測定:荷瘤后隔日測量各組小鼠體質(zhì)量及移植瘤的最大長徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積并繪制生長曲線;末次干預(yù)24小時(shí)后處死小鼠，解剖出腫瘤組織稱其體質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率。
　　5.免疫組化SP法檢測

5、各組腫瘤組織微血管密度(MVD)。
　　6.Western blotting檢測各組腫瘤組織中VEGF-A和HIF-1α的表達(dá)。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織中MDSC、TAM(M1/M2)、mDC和CD8+T細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：
　　1.與A組相比，B組及C組小鼠體質(zhì)量及腫瘤體積增長緩慢，B組腫瘤質(zhì)量小于A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑瘤率為25％;C組腫瘤質(zhì)量明顯小于A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

6、(P＜0.01)，抑瘤率為52％。
　　2.MVD計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果示B組與A組相比MVD計(jì)數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);C組與A組相比MVD計(jì)數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.Western blotting結(jié)果顯示，與A組相比，B組(P＜0.05)及C組(P＜0.01)腫瘤組織內(nèi)的VEGF-A蛋白表達(dá)水平下降，HIF-1α蛋白表達(dá)水平增加
　　4.流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與A組相比，