超聲造影評(píng)價(jià)小鼠Lewis肺癌血管生成及恩度的抗腫瘤血管生成治療的療效.pdf

1、第一部分:超聲造影定量分析評(píng)價(jià)小鼠Lewis肺癌腫瘤血管的生成
　　研究背景及意義
　　腫瘤血管生成即指在腫瘤原有微血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上通過內(nèi)皮細(xì)胞的“芽生”方式形成新生血管的過程，它是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的一個(gè)至關(guān)重要的因素。在腫瘤內(nèi)及周圍的血管生成被認(rèn)為是惡性腫瘤細(xì)胞增殖的前提，這些新生血管不但能夠提供腫瘤細(xì)胞增殖所需的營養(yǎng)，也為腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了通道。所以血管生成是惡性腫瘤的重要特征，它的檢出對(duì)于腫瘤的診斷、治療與預(yù)后

2、相當(dāng)重要。
　　在過去的幾年中，許多研究通過無創(chuàng)的影像學(xué)方法來評(píng)估腫瘤血管的生成，例如對(duì)比增強(qiáng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(contrastenhancedcomputedtomography，CECT)、動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(dynamiccontrastenhancedmagneticresonanceimaging，DCE-MRI)，磁共振血管成像技術(shù)(magneticresonanceangiography，MRA)、正電子發(fā)射斷層掃

3、描(positronemissiontomography,PET)和多普勒超聲診斷技術(shù)等等。然而，以上這些方法在檢測(cè)低速血流和微小血管上，具有明顯的局限性。超聲造影明顯提高了對(duì)低速血流的檢出能力，使評(píng)價(jià)組織內(nèi)毛細(xì)血管和微血管的血流成為可能，并可提供關(guān)于腫瘤血管的詳細(xì)信息。
　　微血管密度即平均每平方毫米腫瘤面積內(nèi)的血管數(shù)，是目前評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的公認(rèn)的參考標(biāo)準(zhǔn)。然而不同血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的微血管密度用于揭示不同腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化

4、程度以及結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。在以往的實(shí)驗(yàn)研究中，較多使用CD31血管標(biāo)志的微血管密度，用以評(píng)價(jià)組織的血管生成情況。由于CD31微血管密度在已分化和未分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá);而另一常用的血管標(biāo)記物CD34則只表達(dá)于已分化的內(nèi)皮細(xì)胞中，故腫瘤血管的分化程度不同，其所代表的微血管密度亦有不同。
　　小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma，LLC)是將傳代培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞接種于C57/BL6小鼠的腋部皮下而成，

5、已經(jīng)多次反復(fù)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)研究中，是較為成熟的動(dòng)物瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　雖然既往已有研究證實(shí)超聲造影的定量分析參數(shù)與腫瘤的微血管密度存在一定的線性相關(guān)關(guān)系，到目前為止，還未有報(bào)道關(guān)于小鼠Lewis肺癌中不同血管標(biāo)記的微血管密度同超聲造影參數(shù)之間的相關(guān)性研究。
　　研究目的
　　本研究通過建立小鼠LLC的皮下移植瘤動(dòng)物模型，應(yīng)用增強(qiáng)脈沖序列(contrastpulsesequencing，CPS)的超聲造影成像技術(shù)，結(jié)合

6、時(shí)間-強(qiáng)度曲線，研究并比較超聲造影的血流灌注參數(shù)與不同血管標(biāo)記的微血管密度在LLC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械南嚓P(guān)性，探討超聲造影在評(píng)價(jià)腫瘤血管生成方面的應(yīng)用價(jià)值。
　　研究方法
　　建立25只小鼠LLC皮下移植瘤模型，待腫瘤大小約1.0cm左右行超聲造影檢查，應(yīng)用超聲造影定量分析軟件進(jìn)行脫機(jī)分析，獲取峰值強(qiáng)度(peakintensity，PI)、達(dá)峰值時(shí)間(timetopeak，TTP)和到達(dá)時(shí)間（arrivaltime，AT）等超聲

7、造影定量分析參數(shù)。
　　超聲檢查結(jié)束后經(jīng)頸椎脫位處死小鼠，完整切除腫瘤，免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)腫瘤的CD31及CD34微血管密度的表達(dá)情況，并分別計(jì)算出微血管密度值(microvesseldensity,MVD)。
　　結(jié)果
　　1.接種后7天出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，模型建立成功。腫瘤的平均直徑約0.9cm，最大直徑為1.3cm，大多呈橢圓形，成瘤率達(dá)100％，且無一例復(fù)種。
　　2.25例小鼠LLC的超聲造影增強(qiáng)模

8、式均表現(xiàn)為環(huán)狀強(qiáng)化，即腫瘤組織周邊部明顯強(qiáng)化，而中央部呈現(xiàn)低強(qiáng)化或無強(qiáng)化。在時(shí)間-強(qiáng)度曲線上上述LLC腫瘤均呈現(xiàn)“快進(jìn)、慢出”的表現(xiàn)，即上升支陡直，迅速達(dá)峰，下降支相對(duì)較緩。
　　3.在小鼠的LLC腫瘤中，存在兩種代表血管內(nèi)皮細(xì)胞不同分化程度的血管標(biāo)記物:CD31和CD34.
　　4.超聲造影的灌注參數(shù)峰值強(qiáng)度(PI)與CD31微血管密度呈正相關(guān)(r=0.428;P＜0.05)與CD34微血管密度無線性相關(guān)。
　　5.

9、在小鼠的LLC腫瘤中，CD31微血管密度與CD34微血管密度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.474;P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功建立了小鼠Lewis肺癌的腫瘤模型，進(jìn)一步證明了該模型是研究組織腫瘤的可靠實(shí)用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工具，并具有較好的可重復(fù)性。
　　2.在小鼠Lewis肺癌腫瘤模型中，存在兩種不同分化程度的腫瘤血管:分別是代表未分化和已分化成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD31微血管密度和只代表分化成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD3

10、4微血管密度。
　　3.超聲定量分析參數(shù)與腫瘤微血管密度的相關(guān)性提示:超聲造影（團(tuán)注法）可以通過監(jiān)測(cè)腫瘤的血流灌注參數(shù)來有效評(píng)價(jià)腫瘤血管生成;其中超聲造影參數(shù)中的峰值強(qiáng)度可以在一定程度上評(píng)價(jià)腫瘤未分化的血管生成，指導(dǎo)臨床應(yīng)用抗血管治療以及評(píng)估腫瘤的分級(jí)和預(yù)后上有著重要的臨床實(shí)用價(jià)值。
　　第二部分:超聲造影定量分析評(píng)價(jià)恩度對(duì)小鼠Lewis肺癌腫瘤的治療療效
　　研究背景及意義
　　抗腫瘤血管生成治療是目前治療腫瘤

11、的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)。由于抗腫瘤血管生成治療的靶向作用于腫瘤內(nèi)異常的新生血管或不成熟血管，其治療會(huì)引起腫瘤內(nèi)血容量、血流灌注速度及其它血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的改變，監(jiān)測(cè)這些血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的改變成為臨床上評(píng)價(jià)抗血管生成治療的有效指標(biāo)。
　　既往多種影像學(xué)檢查方法（如CT、MRI及超聲等）都曾來評(píng)價(jià)腫瘤血管的生成和抗腫瘤血管生成治療的療效。超聲檢查尤其是彩色多普勒超聲由于具有實(shí)時(shí)、費(fèi)用低、重復(fù)性好以及能直接評(píng)價(jià)腫瘤的血流灌注等優(yōu)點(diǎn)，在評(píng)價(jià)腫瘤血管

12、生成及抗血管生成治療中起著重要的作用。但彩色多普勒超聲對(duì)微血管的顯示及評(píng)價(jià)微血管的血流灌注有一定的局限性，近年來超聲造影更多的應(yīng)用于臨床，使對(duì)腫瘤內(nèi)微小血管內(nèi)血流的評(píng)價(jià)成為可能。在一定濃度范圍內(nèi)，超聲造影的信號(hào)強(qiáng)度與血液內(nèi)微泡濃度存在線性關(guān)系，故可利用時(shí)間-強(qiáng)度曲線軟件對(duì)超聲造影過程進(jìn)行定量分析。
　　恩度(endostar)即重組人血管內(nèi)皮抑素，是一種血管生成抑制藥物，其可能作用機(jī)理是通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移達(dá)到抑制腫瘤

13、新生血管的生成，阻斷了腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的。臨床主要應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的抗腫瘤血管生成治療。
　　由于血管生成抑制藥物主要作用于腫瘤內(nèi)的異常新生血管，治療后不僅會(huì)引起組織內(nèi)血管數(shù)目的變化，更重要的是會(huì)引起腫瘤血管的形態(tài)、以及功能的改變，上述改變往往繼發(fā)了腫瘤內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)的異常，因此監(jiān)測(cè)此異常變化可以成為臨床上評(píng)估抗血管生成治療的一個(gè)可靠手段。
　　研究目的
　　本研究擬采用Lewis肺癌荷瘤小鼠模

14、型應(yīng)用腹腔內(nèi)注射抗血管藥物恩度治療后與對(duì)照組的超聲造影血流灌注參數(shù)進(jìn)行對(duì)照性研究，并將超聲造影參數(shù)與腫瘤的微血管密度進(jìn)行相關(guān)性比較，旨在探討超聲造影對(duì)評(píng)價(jià)抗腫瘤血管生成藥物療效的作用。
　　研究方法
　　建立30只小鼠LLC皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為2組，各模型自建立次日起分別經(jīng)腹腔注射生理鹽水鈉(normalsaline，NS)、恩度（5mg/kg體重），每天給藥，連續(xù)給藥14天。用藥后每天觀察兩組小鼠的一般情況，并每隔一天

15、測(cè)定小鼠腫瘤的大小。
　　末次給藥24h后行超聲造影檢查，并應(yīng)用超聲造影定量分析軟件進(jìn)行脫機(jī)分析，獲取峰值強(qiáng)度(PI)、達(dá)峰時(shí)間(TTP)和到達(dá)時(shí)間(AT)等參數(shù)。超聲檢查結(jié)束后頸椎脫位處死小鼠，并完整切除腫瘤，免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤CD31的表達(dá)情況，并計(jì)算腫瘤的微血管密度(MVD)。
　　1.接種后7天出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，模型建立成功，腫瘤的平均直徑約為0.9cm，最大直徑1.3cm，大多呈橢圓形，成瘤率達(dá)100％，且無一

16、例復(fù)種。
　　2.對(duì)小鼠一般情況的影響
　　用藥后生理鹽水組小鼠隨著移植瘤結(jié)節(jié)的逐漸長大，進(jìn)食、飲水、活動(dòng)均較前減少;恩度組小鼠進(jìn)食、飲水較前無明顯變化，活動(dòng)正常，持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，恩度藥物干預(yù)組小鼠LLC皮下移植瘤體積(1762.72±53.08mm3)明顯低于生理鹽水對(duì)照組（2503.72±64.78mm3），兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　3.對(duì)移植瘤微血管密度的影響
　　

17、以CD31作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿被染成棕黃色。NS組及恩度組CD31MVD計(jì)數(shù)平均值分別為98.50±13.53、56.21±5.10。與NS組比較，恩度藥物干預(yù)組MVD值減低且差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　4.超聲造影軟件定量分析
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，恩度治療組的峰值強(qiáng)度(PI)明顯低于生理鹽水對(duì)照組(p＜0.05)，其峰值強(qiáng)度分別為50.74±5.82及88.56±25.99。
　　5.超

18、聲造影的定量分析參數(shù)與腫瘤微血管密度之間的關(guān)系
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后恩度組超聲造影參數(shù)峰值強(qiáng)度(PI)與腫瘤的CD31微血管密度呈正相關(guān)（r=0.532，p＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）能夠有效抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的生長。
　　2.超聲造影定量分析（團(tuán)注法）可以通過監(jiān)測(cè)腫瘤的血流灌注參數(shù)的改變來評(píng)價(jià)恩度抗血管生成治療的效果。
　　3.超聲造影定量分析參數(shù)中的峰值強(qiáng)度可以有