腫瘤血管生成及檢測

1、腫瘤血管生成 及檢測重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室葉秀峰,,,人體腫瘤大部分為實體瘤(solid tumors)。實體瘤瘤組織由瘤細胞和間質(zhì)構(gòu)成，后者主要包括血管、淋巴管、結(jié)締組織、炎細胞及細胞外基質(zhì)等成分。其中，血管和結(jié)締組織起營養(yǎng)、支持瘤細胞的作用。,腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實現(xiàn)的，并在腫瘤的生長和擴散(侵襲和轉(zhuǎn)移)中起重要作用。已有研

2、究證明，腫瘤血管生成活躍程度對組織病理分級、放射治療以及在預(yù)后判斷上都有重要的評估價值。,,第一節(jié) 腫瘤血管生成的基本過程一、血管生成現(xiàn)象(一)血管生成的概念1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumor angiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對血管生成重要性的認識，特別是提出“腫瘤生長依賴于血管生成”觀點，始于1 971年Folkman對腫瘤血管生成的研究報道。,,,血管

3、生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生(sprouting)出新的以毛細血管為主的血管系統(tǒng)的過程。有別于胚胎時期由早期內(nèi)皮細胞分化形成新血管的過程即血管形成(vasculogenesis) (二)血管生成的研究方法雞胚絨毛尿囊膜試驗角膜移植實驗,,開窗實驗動物移植瘤等在體模型三維膠分析法細胞聯(lián)合培養(yǎng)等離體模型 識別內(nèi)皮細胞的免疫學(xué)標(biāo)記物 :第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelated antigenFⅧAg)、CD3

4、l、CD34、CDl05 血管生成因子:VEGF及其受體家族 FGF家族及其受體 Ang和Tie受體家族 Angiotropin血小板源內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF),,二．腫瘤血管生成的基本過程(一)血管生成的基本過程血管生成的基本步驟是①血管生成因子的產(chǎn)生過多使之與抑制因子失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞激活，產(chǎn)生血管生成表型；②血管部位細胞外基質(zhì)改變、基底膜降解，內(nèi)皮細胞芽生、增殖和遷移；,,③新生內(nèi)皮

5、細胞索形成管狀毛細血管襻及管腔；④新生血管管腔的貫通。內(nèi)皮細胞凋亡、脫離基底膜和血管壁細胞改變可能是血管消退的主要病理學(xué)事件。(二)腫瘤血管生成的過程1．腫瘤生長的階段性 ①無血管期(avascular phase)或稱血管前期(prevascular phase) 腫瘤直徑不超過1～2mm,,②血管期(vascular phase) 腫瘤迅速生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移 2.腫瘤血管的起源 腫瘤中的血管可能有3種來源：

6、①血管生成:以兩種方式發(fā)生,一是腫瘤細胞團先處于無血管期生長，后因缺氧而產(chǎn)生大量血管生成因子，從而誘導(dǎo)血管生成；另一種是瘤細胞先依賴宿主組織已存在的血管生長，繼而出現(xiàn)瘤內(nèi)血管消退，然后再因缺氧誘導(dǎo)血管生成因子作用而發(fā)生血管生成 ②血管套疊性生長,,③內(nèi)皮祖細胞3．腫瘤血管生成的過程 瘤細胞和巨噬細胞 血管生成因子(VEGF等) 　　小血管毛細血管伸展　　　內(nèi)皮細胞遷移形成毛細血管芽　　　新生毛細血管形成并連通,,,,

7、,,第二節(jié) 腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學(xué)功能上也有其特殊性。一．腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱為所謂“血管熱點區(qū)”(hot spots)，這也是進行腫瘤微血管密度測定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。,,腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)

8、為狹窄、擴張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內(nèi)皮細胞；或管壁很厚，但結(jié)構(gòu)上仍然不完善。內(nèi)皮細胞～般比較幼稚，細胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時血管外的腫瘤細胞可直接與血管管腔相連。腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是這些血管具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。,,不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。生長活躍的惡性腫瘤常富于血管．如內(nèi)分泌腫瘤．腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤和

9、肝細胞癌等，而硬癌、軟骨瘤和軟骨肉瘤中血管甚少。不同腫瘤血管的形態(tài)又有一定的差異，如膠質(zhì)母細胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內(nèi)皮細胞呈不同程度的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細胞癌等血管呈壁薄、明顯擴張的血竇。,,以惡性膠質(zhì)瘤為例，腫瘤組織內(nèi)新生血管的主要表現(xiàn)形式有:①梭形內(nèi)皮細胞呈索狀排列，枝狀分布，有或無明顯的血管腔，呈原始、幼稚的微血管②內(nèi)皮細胞增生、肥大，管腔狹小，呈現(xiàn)厚壁血管③內(nèi)皮細胞增生，形成球形血管壁內(nèi)血管．呈現(xiàn)“腎小球樣結(jié)

10、構(gòu)”；④管腔大、管壁較薄的相對較大的微血管，并形成血管心假菊形團結(jié)構(gòu)；⑤大量管壁退變和鈣化的新生血管；,,⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；⑦血管內(nèi)皮區(qū)域性極度增生，呈片狀的梭形細胞，構(gòu)成“假肉瘤化”。二、腫瘤微血管的生物學(xué)特性①低反應(yīng)性②高通透性③低供氧能力,,最近，Vogelstein B和Kinzler KW采用基因表達的系列分析(serial analysis of gene expres

11、sion SAGE)方法，比較研究了結(jié)直腸癌和正常腸黏膜血管內(nèi)皮細胞的基因表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)．二者基因表達存在差異。他們得到了79種差異表達的轉(zhuǎn)錄子，其中TEM8僅表達于腫瘤內(nèi)皮而不表達于黃體形成中的內(nèi)皮細胞，提示腫瘤血管生成和生理狀態(tài)下的血管生成有明顯不同。這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎(chǔ)和臨床研究提供了重要資料，也引起了血管生成和腫瘤治療研究者的重視。,,第三節(jié) 腫瘤血管生成的調(diào)控機制 腫瘤血管生成受

12、多種血管生成因子(angiogenic factors)和血管生成抑制物(angiogenesis inhibitors)的調(diào)控。腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變化的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進血管生成。組織中同時也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對血管生成起抑制作用。,,一、血管生成因子 血管生成的始動需要血管生成因子。一系列血管生成因子、細胞因子、細胞外基質(zhì)和黏附分子及其抑制物，以

13、及代謝性和機械性因子均參與了血管生成過程。 已知的血管生成因子有數(shù)十種，其中VEGF和Ang家族是已知的、特異性作用于內(nèi)皮細胞的生長因子，在血管生成中作用可能也是最為重要的。,,(一)VEGF及其受體家族 1．VEGF家族及其愛體 VEGF又稱血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)，為分子量34~45kD的同源二聚體糖蛋白，屬于堿性蛋白。VEGF基因通過轉(zhuǎn)錄水平的

14、剪切，可產(chǎn)生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個氨基酸組成。,,其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴散力強，易于到達靶細胞。 近年又發(fā)現(xiàn)其他一些與VEGF功能相似、結(jié)構(gòu)上有一定同源性的多肽因子，包括胎盤生長因子(placentor growth factor，PIGF)，VEGF-B

15、(VEGF相關(guān)因子，VEGF-related factor，VRF)，VEGF-C(VEGF相關(guān)蛋白，VEGF-related protein，VRP)，以及VEGF-D／FIGF和VEGF-E等成員，它們共同構(gòu)成VEGF家族,,VEGF受體包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1／KDR)和 VEGFR-3(Flt-4) 2．VEGF及其受體的作用 :早期血管的形成需要VEGF的調(diào)節(jié)，它們與內(nèi)皮細胞上相應(yīng)的

16、酪氨酸激酶受體結(jié)合，引起內(nèi)皮細胞分裂和分化，并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF(主要是VEGF-A)通過其受體VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1／KDR)促進內(nèi)皮分化、增殖、遷移和原始血管形成.,,由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR-1的表達和激活，而VEGFR-3的表達與內(nèi)皮細胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。VEGF不僅是內(nèi)皮細胞特異的強效有絲分裂原，而且能促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生并調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物及其

17、抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。VEGF在幾乎所有的人體腫瘤和腫瘤細胞株中皆有過表達。VEGF及其受體在腫瘤中的表達常與腫瘤分化程度密切相關(guān)。,,大多數(shù)實體瘤VEGF基因均有過表達，VEGF165 VEGF121兩種VEGF最常見。 在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可誘導(dǎo)血管生成，又可誘導(dǎo)淋巴管生成。已有研究報道，人體多種腫瘤細胞高表達VEGF-C。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炓沧C實，腫瘤細胞VEGF-C

18、的高表達能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管生成。腫瘤組織中的VEGF-C和VEGF-D還來源于浸潤的巨噬細胞。,,缺氧是包括膠質(zhì)瘤細胞在內(nèi)的許多細胞系產(chǎn)生VEGF的一個強烈的誘導(dǎo)因子 離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達的誘因。VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強表達。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)節(jié)作用。多種癌基因的激活通過上調(diào)VEGF表達而誘導(dǎo)血管生成，失活的抑癌基因(

19、如突變型p53基因)也參與了VEGF介導(dǎo)的血管生成過程。,,(二)FGF家族及其受體1．FGF家族 目前研究最為深入的是堿性戒纖維細胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)。bFGF和aFGF在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，二者之間有53％的序列同源。 2．FGF的分布和生物學(xué)作用 bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長因子之一，可在不同腫瘤中表達，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細胞

20、系都可以合成它。,,其功能具有多樣性，可促進內(nèi)皮細胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生膠原酶降解基底膜，誘導(dǎo)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細胞的增殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進神經(jīng)元的存活和分化。 bFGF和aFGF均與肝素有很強的親和力，研究表明這種高親和力對于FGF與細胞表達的受體結(jié)合是非常重要的。,,3．FGF受體 bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)G

21、FR)結(jié)合而介導(dǎo)實現(xiàn)的。已經(jīng)識別4種FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和FGFR-4。FGFR-1在bFGF／FGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中FGFR-1的表達呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，即組織中有些細胞呈現(xiàn)FGFR-1陽性，有些則顯示陰性；血管內(nèi)皮細胞亦是如此。,,(三) Angiotropin AngiOtropin是一個含銅離子的4．5kD核酸與多肽的聚合物。將angiot

22、ropin加入到已匯合的毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，它以劑量依賴方式刺激內(nèi)皮遷移并快速排列成管樣結(jié)構(gòu)，這種效應(yīng)對內(nèi)皮細胞是特異的。由于它是巨噬細胞產(chǎn)生的化學(xué)調(diào)節(jié)劑，所以它可能啟動炎癥和傷口愈合中的血管生成過程。,,（四）血小板源內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF) PD-ECGF是一個酸性45kD單鏈多肽。 它是內(nèi)皮細胞特異的有絲分裂素，能刺激人和豬的內(nèi)皮細胞增生。用PD-ECGF轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，其裸鼠移植瘤血管密度明顯增加。

23、(五) 其他血管生成因子Ang和Tie受體家族 EGF TGF 粒細胞集落刺激因子／粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(G-CSF／GM—CSF),,(七)降解基底膜的相關(guān)物質(zhì) 血管基底膜的降解是血管生成過程中的重要事件，只有基底膜降解之后，內(nèi)皮細胞才能遷移入周圍組織并形成血管芽?；啄さ慕到馐且粡?fù)雜過程，涉及一系列酶的作用，這些酶包括基質(zhì)金屬蛋白溶酶、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(urokinase-type

24、 plasminogen,u-PA)；絲氨酸蛋白酶(serine proteases)、細胞外蛋白體(proteasome)、糖苷酶(endoglycosidases)、組織蛋白酶(cathepsins)和多形核白細胞絲氨酸蛋白酶(serine proteinase)。,,u-PA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。U-PA使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)為纖維蛋白溶酶,后者能降解基質(zhì)蛋白并激和幾種基質(zhì)金屬蛋白酶。(八)細胞外基質(zhì)和基質(zhì)黏附受

25、體 在血管生成型中不但需要細胞因子與相應(yīng)受體的結(jié)合，細胞外基質(zhì)(extraceIlular matrix, ECM)也起著重要作用。 內(nèi)皮細胞獨自在接受生長因子的刺激時只表現(xiàn)增生，而在有細胞外基質(zhì)的條件下，內(nèi)皮細胞才能形成管腔樣結(jié)構(gòu)。,,二、缺氧對血管生成的誘導(dǎo)作用 缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子包括缺氧誘導(dǎo)因子-1、-2(hypoxia inducing factor-l

26、，-2，HIF-1．HIF-2)和NF-КB,其中以HIF-l在血管生成中的作用最為重要。 在腫瘤組織中，缺氧一方面可導(dǎo)致瘤細胞死亡，另一方面也刺激殘留瘤細胞上調(diào)血管生成因子的表達。,,第四節(jié) 血管生成的有關(guān)檢測方法 一.腫瘤血管生成的體內(nèi)研究動物模型 腫瘤血管生成體內(nèi)研究的生物試驗?zāi)Ｐ椭饕袆游?大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)等四種動物模型。國內(nèi)學(xué)者對這四種模

27、型均有研究。有研究認為CAM是研究血管生成較好的實驗?zāi)Ｐ停浞椒ê啽愣杀镜?，儀器設(shè)備條件要求不高，易于操作，便于推廣；并可用于進行大樣本研究，或用于影響血管生成的因素或藥物的篩選和評價。因此，特將CAM試驗方法作簡單介紹：,,雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗:(1)．雞胚準(zhǔn)備和接種組織：選擇北京白雞種蛋，洗凈，用l：1000苯扎溴銨(新潔爾滅)液浸泡3分鐘，置37．8土0．5℃培養(yǎng)箱中孵育。雞胚發(fā)育第7天，蛋殼消毒后，標(biāo)記制作2cmX3

28、cm左右觀察窗。接種組織視研究目的而定，一定要在接種當(dāng)日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm組織小塊。(2)組織接種：在制備雞胚觀察窗的次日，即雞胚發(fā)育第 8天進行組織接種。每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。,,(3)接種組織的收獲與觀察： 組織接種后每12小時觀察一次，到組織接種第11天(雞胚發(fā)育第18天)收獲接種組織，取出雞胚，置接種組織連同周圍的CAM于解剖顯微鏡下觀察

29、，并用10％甲醛固定保存，部分組織可作石蠟切片，用作血管生成研究的免疫組化染色等。 (4)CAM的血管生成表現(xiàn)：組織接種24小時后，CAM血管開始向接種組織生長，隨培養(yǎng)時間的延長，血管數(shù)目及直徑均明顯增加；第2天，新細小血管直接趨向組織；,,第3天，新生血管形成以接種組織為中心，10～20條放射狀血管網(wǎng)；爾后，CAM血管繼續(xù)明顯增加。非接種部位與接種部位比較，CAM血管數(shù)目少，大血管與小血管呈脈樣均勻分布；而接種部位的CAM血管在接

30、種組織周圍彌散樣增加，以組織為中心向周圍呈放射狀分布，在首 先與組織發(fā)生聯(lián)系的區(qū)域CAM血管更多。第4天，可見 新生細小CAM血管生長形成中、粗血管，并在中、粗血管繼續(xù)分支出細小血管，形成新的血管網(wǎng)。CAM血管管腔結(jié)構(gòu)清晰，可區(qū)別動、靜脈。,,(5)CAM血管生成實驗?zāi)Ｐ偷挠猛荆篊AM血管生成模型用于血管生成的研究，可取得兩方面結(jié)果：①檢測評價接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促進因子、抑制因子的活性和作用的

31、檢測，如腫瘤血管生成的研究等；②對接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進行研究，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用.,,對照,抗血管生成藥物作用以后,,盡管血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)，使研究結(jié)果更為可靠，但Kathryn等認為仍有一些不足之處，如操作繁瑣，耗時過長；另外，在該類模型中，血管生成物必須植入眼角膜囊、頰囊、或絨毛尿膜囊使之誘導(dǎo)血管生成，難免產(chǎn)生人為因素誘導(dǎo)的血管生成；

32、血管生成促進因子、抑制因子等需要從多聚載體中釋放出來；操作方法和測定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。由于這些不利之處，最近，Kathryn等又建立了一種新的血管生成模型:二.人胎盤血管培養(yǎng)實驗(體外)Kathryn等認為不但既往的體內(nèi)血管生成實驗研究模型有上述不足之處，而體外的血管生成實驗研究也主要是內(nèi)皮細胞的長期培養(yǎng)，將內(nèi)皮細胞置于細胞外基質(zhì)環(huán)境，或者暴露于各種血管生成刺激因子，使之誘導(dǎo)其血管形成。,,該類體外實驗研究，有很多人為因素影響，

33、不能代表體內(nèi)生理反應(yīng)，因為內(nèi)皮細胞在生長因子存在的條件下培養(yǎng)了很長一段時間，已被激活。因此，有必要建立一類與體內(nèi)生理反應(yīng)有關(guān)的血管生成實驗方法，尤其是與人類血管生成有關(guān)的血管生成實驗。 于是，Kathryn等建立了一種新的人血管生成模型。從自愿選擇剖腹產(chǎn)手術(shù)24小時之內(nèi)的人胎盤頂端表面截取約長2～5cm，直徑為l～2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。,,培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中進行，可在孔中分別加入各種血

34、管生成因子，再加l99培養(yǎng)基，將血管片段在凝固前迅速加入培養(yǎng)孔中央，理想的是使血管片段懸浮于培養(yǎng)膠中。然后將培養(yǎng)板置37℃保濕孵育培養(yǎng)14～21天，每周換培養(yǎng)基2次。用減數(shù)成相系統(tǒng)計；算原來血管條生成的血管索數(shù)量，每隔一天計數(shù)新生長形成的微血管條數(shù)，由此描繪微血管生長曲線。,,用免疫組化、流式細胞儀、電鏡等分別檢測了CD34，Weibel-Palade小體標(biāo)志物等， 證實新生血管中含有內(nèi)皮細胞。該實驗?zāi)Ｐ筒?需要加外源性生長因子，并用該

35、模型檢測研 究了aFGF、bFGF，三種VEGF異構(gòu)體及其受 體在原代血管生長及子代新生血管形成中的作用。結(jié)果表明該模型是篩選人類血管生成潛在 激活增強因子和抑制因子行之有效的體外實驗 模型。,,三.腫瘤微血管密度計數(shù)(MVD) 用FⅧ因子單克隆抗體在組織切片上進行免疫組織化學(xué)染色 ,血管內(nèi)皮細胞呈棕黃色 。 MVD計數(shù)按Weidner等的方法并加以改動，先在低倍視野內(nèi)找到M

36、VD最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)計數(shù)微血管的數(shù)目。分辨不清或染色模糊的細胞不計入結(jié)果，單個的棕黃色內(nèi)皮細胞或細胞簇作一個血管計數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積>8個紅細胞直徑的血管不計數(shù)。計5個視野的IMVD，取其平均值作為IMVD。,,四.腫瘤血管生成調(diào)控因子的檢測 以VEGF為例,根據(jù)實驗條件和需要可以從蛋白質(zhì)水平或核酸水平進行檢測:(一)免疫組織化學(xué)檢測 用VEGF單克隆抗體在組織切片或細

37、胞爬片上進行免疫組織化學(xué)染色 , 腫瘤細胞胞漿呈棕黃色 。,培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細胞 VEGF陽性表達,培養(yǎng)的腦星形細胞瘤細胞VEGF陽性表達,培養(yǎng)的腦星形細胞瘤細胞VEGF陽性表達,,(二)Western blot基本原理:　 免疫印跡又稱Western印跡(Western   blot)，與DNA的Southern印跡技術(shù)相對應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測特異

38、性組分。不同的是，Western blot所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進行放射性標(biāo)記。,,Western blot的過程分四階段a.蛋白樣品的制備

39、及蛋白樣品濃度測定b. SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE） c.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜)d.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(雜交)1.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定A.樣品的制備組織的處理方法：組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入

40、0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。,,細胞的處理方法： 離心收集細胞或者直接往細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。分泌蛋白的提取： 直接收集分泌液，

41、加入β-ME、溴酚藍制樣。B.蛋白的定量方法:a.雙縮脲法：b. Lowry法：c.紫外吸收法 :e. Bradford比色法：,,2.SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）A：實際操作做膠前的準(zhǔn)備1)檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb 和架子。2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。3)按將要檢測的抗體對應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。制膠

42、，電泳1）裝好架子。2)按照>配方配制分離膠。在膠上面加入一層蒸餾水，促進膠更好的凝集。3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。,,倒好濃縮膠后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。4)待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時，用100-120V電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。注意事項及常遇到的問題1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空 間，否則起不到濃縮效果。2）上樣蛋白量不應(yīng)超過樣品槽。

43、3）gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好，過快表TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實際不純或失效。,,4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。 5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象： ︶ 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。 ︵ 條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚

44、合不完全。 拖尾：樣品溶解不好。 紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。 條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。 條帶兩邊擴散：加樣量過多。,,3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜): 在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。 膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學(xué)兼容性

45、。,,轉(zhuǎn)膜有2種方法:A .半干法 即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。1) 實驗條件的選擇 電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間，具體可以根據(jù)實際適當(dāng)調(diào)整。,,目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度

46、 轉(zhuǎn)移時間(h) 80---140 8% 1.5-2.0 25---80 10 1.5 15—40 12 0.75 <20

47、 15 0.52 )實驗操作 （1）濾紙和膜的準(zhǔn)備 (在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作)。a.檢查是否有足夠的transfer buffer，沒有立即配制b.檢查是否有合適大小的濾紙和膜。,,c.將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transfer buffer中。d.將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。（2）轉(zhuǎn)移a.在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。

48、一般用三層。b.將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤。c.將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。d.剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。e.將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。f.裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時間。g.轉(zhuǎn)移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時調(diào)整。,,,3 注意

49、事項及常遇到的問題1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。5）轉(zhuǎn)移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm

50、2，10% gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。B .濕法這里暫不做介紹。,,C .轉(zhuǎn)移后效果的鑒定 1．染膠 用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉(zhuǎn)移的效果。 2．染膜 有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類染 料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進一步的分析用。但是

51、不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于進一步的分析。,,4.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(雜交)a、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。b.封閉（block）: 封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。 常用的封閉液有:bovine serum albumin(BSA)， non-fat milk，tween-20等，我們一

52、般用non-fat milk。 在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk(TBST溶解)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后 將膜放入milk中block(一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜)，并清洗整理好用過的濾紙，以便下次使用。 Block 4°C 1小時。,,c.棄封閉液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。 d.加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體 必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置

53、12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。e.棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。f.加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr。g.棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。h.加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。,,,注意事項:1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同