梨‘中矮1號(hào)’矮生基因的篩選及PcAHS克隆與表達(dá)分析.pdf

1、‘中矮1號(hào)’是從‘錦香’梨實(shí)生后代中選出的優(yōu)良梨矮化砧木。樹(shù)體矮小緊湊，作砧木促進(jìn)樹(shù)體矮化，但其矮生和致矮機(jī)理尚不清楚。
　　以‘中矮1號(hào)’及‘錦香’新梢嫩葉為試材，進(jìn)行RNA-Seq分析，共獲得2個(gè)品種46619個(gè)unigenes，其中長(zhǎng)度大于1000 bp占23.25％，約71％的unigenes至少具有1條注釋。使用IDE6軟件對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)分析，控制FDR低于0.05，并且基因的最高表達(dá)量達(dá)到最低表達(dá)量的1.5倍時(shí)，該基因

2、為差異表達(dá)基因?！邪?號(hào)’和‘錦香’中存在很多個(gè)差異表達(dá)的基因，有些可以作為矮化相關(guān)的候選基因，包括1個(gè)編碼GA-3氧化酶基因，5個(gè)編碼生長(zhǎng)素相關(guān)蛋白基因，4個(gè)編碼細(xì)胞色素P450蛋白基因，1個(gè)編碼類(lèi)LRR受體絲氨酸/蘇氨酸激酶基因;2個(gè)編碼脫落酸合成酶基因，3個(gè)編碼乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因，6個(gè)編碼水分相關(guān)蛋白基因，2個(gè)NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子和4個(gè)WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因。從中選取10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明qRT-PCR

3、結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致。
　　在上述差異表達(dá)的基因中，有1個(gè)注釋為生長(zhǎng)素氫轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因在‘中矮1號(hào)’中為低表達(dá)，可能限制生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸而導(dǎo)致‘中矮1號(hào)’矮生。因此，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，分別在‘中矮1號(hào)’和‘錦香’中克隆到了該基因序列。其全長(zhǎng)1239 bp，在2個(gè)品種間沒(méi)有序列差異，均編碼412個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與蘋(píng)果(NM001293843.1)、梅（xp_008242099.1）、毛果楊(xp_002

4、306421.2)、草莓(xp_004287713.1)的生長(zhǎng)素氫轉(zhuǎn)運(yùn)體基因氨基酸序列的相似性在67％～99％之間，將其命名為PcAHS。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在新梢旺盛生長(zhǎng)期，PcAHS基因在‘中矮1號(hào)’新梢韌皮部中的表達(dá)量均低于母本‘錦香’，推測(cè)二者啟動(dòng)子序列可能存在差異。分別克隆了‘中矮1號(hào)’及其母本‘錦香’PcAHS基因上游啟動(dòng)子序列片段，長(zhǎng)度分別為828 bp和888 bp，二者相似性為89.1％。序列分析發(fā)現(xiàn)‘中矮1號(hào)’P

5、cAHS基因啟動(dòng)子上有一段58 bp(-496 bp～-553 bp)的缺失;利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE和PLANTCARE分析表明，2個(gè)品種啟動(dòng)子上除了含有TATA-box、CAAT-box等共有的轉(zhuǎn)錄必需調(diào)控元件外，‘中矮1號(hào)’中還含有一個(gè)‘錦香’沒(méi)有的BPBF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的P-box元件。推測(cè)‘中矮1號(hào)’PcAHS基因啟動(dòng)子上所特有的P-box轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件和片段缺失可能是導(dǎo)致其表達(dá)量低的原因，并通過(guò)影響生長(zhǎng)素的運(yùn)輸最