新孢子蟲P0基因的真核表達(dá)及DNA疫苗的初步研究.pdf

1、新孢子蟲病(Neosporosis)是由犬新孢子蟲(Neospora caninum)引起的一種世界范圍流行、多種動(dòng)物共患的原蟲病，主要引發(fā)犬神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病及牛嚴(yán)重的繁殖障礙性疫病，孕牛頻發(fā)流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱胎等一系列臨床癥狀，該病給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，還沒有防制新孢子蟲病的有效措施，一般認(rèn)為疫苗免疫是預(yù)防牛流產(chǎn)和降低經(jīng)濟(jì)損失的可行性措施，因此，開發(fā)新疫苗已成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。
　　新孢子蟲核糖體磷蛋白P0(Ribos

2、omal phosphoprotein P0，NcP0)可作為新孢子蟲和剛地弓形蟲之間的交叉反應(yīng)性抗原，其抗體可抑制這兩種蟲體的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出P0蛋白全長(zhǎng)基因序列，并將其克隆入真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建pVAX1-NcP0表達(dá)質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定。用脂質(zhì)體法將陽性克隆瞬時(shí)轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)和IFA檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況。結(jié)果表明克隆的P0蛋白基因序列全長(zhǎng)為137

3、9 bp，構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng)鑒定無誤。RT-PCR結(jié)果顯示目的基因已被成功轉(zhuǎn)錄。IFA檢測(cè)證明目的基因被成功表達(dá)。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了新孢子蟲核糖體磷蛋白(NcP0)的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，獲得了新孢子蟲核糖體磷蛋白(NcP0)的瞬時(shí)表達(dá)。將大量提取并純化的pVAX1-NcP0質(zhì)粒添加佐劑免疫沙鼠，測(cè)定沙鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。
　　應(yīng)用IFAT對(duì)免疫后沙鼠每周抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，Cp-M佐劑

4、組、pVAX1-NcP0組的抗體效價(jià)均高于pVAX1空載體組和對(duì)照組，其中Cp-M組效價(jià)最高，攻毒后，Cp-M佐劑組、pVAX1-NcP0組比pVAX1空載體組和對(duì)照組抗體水平上升顯著，Cp-M佐劑組、pVAX1-NcP0組分別與pVAX1空載體組和對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01）。
　　免疫沙鼠的細(xì)胞免疫測(cè)定分別采用檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+百分含量及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示疫苗Cp-M佐劑組、pVAX1-N

5、cP0組的CD4+細(xì)胞含量均高于pVAX1空載體組和對(duì)照組，Cp-M組、pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組和對(duì)照組均差異極顯著（P＜0.01），其中Cp-M佐劑組最高。
　　Cp-M組、pVAX1-NcP0組的CD8+細(xì)胞含量均高于pVAX1空載體組和對(duì)照組，Cp-M佐劑組與pVAX1空載體組和對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組差異不顯著。Cp-M組、pVAX1-NcP0組的CD4+

6、/CD8+值均高于pVAX1空載體組和對(duì)照組，Cp-M組、pVAX1-NcP0組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），Cp-M組、pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組差異不顯著。Cp-M組、pVAX1-NcP0組的CD4+/CD8+值均高于pVAX1空載體組和對(duì)照組，Cp-M組、pVAX1-NcP0組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），Cp-M組、pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組差異不顯著。攻毒試驗(yàn)后經(jīng)計(jì)算得出疫苗保護(hù)率分別為