人工合成肺孢子菌p55嵌合基因DNA疫苗的構(gòu)建及其對(duì)大鼠免疫保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及生物分析軟件分析p55抗原表位，選取肺孢子菌的優(yōu)勢(shì)抗原表位，人工合成了一段串聯(lián)嵌合基因，命名TAG。構(gòu)建了TAG的原核表達(dá)載體，對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫原性分析;將TAG基因插入真核表達(dá)載體pIRES-hrGFP-1a，構(gòu)建了多表位DNA疫苗pIRES-hrGFP-1a/TAG，將該疫苗導(dǎo)入293細(xì)胞，觀察其體外真核表達(dá)水平;用pIRES-hrGFP-1a/TAG做為DNA疫苗免疫大鼠，研究其在免疫抑制的

2、肺孢子肺炎大鼠模型中免疫潛力，為PCP疫苗的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);研究結(jié)果還可為PCP的免疫學(xué)診斷提供有用的方法。
　　方法：
　?。ㄒ唬┤斯ず铣蒚AG串聯(lián)基因的原核表達(dá)產(chǎn)物GST-TAG重組蛋白免疫原性分析
　　1、應(yīng)用GST-TAG重組蛋白制備免疫多克隆抗體
　　BALB/c純系小鼠隨機(jī)分成GST-TAG、GST及空白組三組，每組各10只，按照多克隆抗體制備過(guò)程進(jìn)行免疫，第3次免疫5d后心臟取血，離心分離血清

3、，保存于-20℃待用。
　　2、Dot Blot檢測(cè)抗體產(chǎn)生
　　采用Dot Blot檢測(cè)方法，應(yīng)用免疫前、后抗血清與GST-TAG蛋白進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)免疫血清抗體的產(chǎn)生。
　　3、多克隆抗體特異性的Western Blot鑒定
　　GST-TAG重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，與免疫小鼠抗血清反應(yīng)，采用Western Blot檢測(cè)抗體特異性。
　　4、免疫小鼠多克隆抗血清鑒定PCP小鼠和正常小鼠肺組織勻漿

4、中的P.carinii
　　將PCP大鼠和正常大鼠肺組織勻漿通過(guò)SDS-PAGE電泳分離，分別與以GST-TAG、GST免疫前、后血清反應(yīng)，應(yīng)用Western Blot進(jìn)行鑒定。
　　5、重組蛋白GST-TAG免疫反應(yīng)性的測(cè)試
　　GST-TAG重組蛋白，常規(guī)方法SDS-PAGE電泳，以PCP小鼠陽(yáng)性血清、正常小鼠血清為一抗分別進(jìn)行Western Blot，檢測(cè)分析其免疫反應(yīng)性。
　?。ǘ┤斯ず铣蒚AG串聯(lián)基因

5、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在真核細(xì)胞中表達(dá)
　　1、pIRES-hrGFP-1a/TAG的構(gòu)建
　　BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pGEX-6p-1/TAG（本實(shí)驗(yàn)室保存）及pIRES-hrGFP-1a質(zhì)粒，回收TAG基因和開(kāi)環(huán)的pIRES-hrGFP-1a質(zhì)粒。用T4連接酶將兩者連接，構(gòu)建pIRES-hrGFP-1 a-p55/TAG真核表達(dá)載體，BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定。
　　2、pIRES-hrGFP-1a-p55在

6、真核細(xì)胞HEK293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
　　真核表達(dá)載體pIRES-hrGFP-1 a-p55/TAG以QIANGEN陽(yáng)離子脂質(zhì)技術(shù)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。
　　3、表達(dá)產(chǎn)物的直接熒光檢測(cè)
　　熒光顯微鏡直接觀察真核表達(dá)載體pIRES-hrGFP-1 a-p55/TAG中的hrGFP，檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。
　　4、翻譯產(chǎn)物的Western Blot檢測(cè)
　　提取細(xì)胞培養(yǎng)上清，丙酮法濃縮細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白。樣品蛋白常規(guī)方

7、法SDS-PAGE電泳，以AntiFLAG-Ab為一抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。
　　（三）TAG串聯(lián)基因DNA疫苗免疫保護(hù)作用研究
　　1、動(dòng)物免疫方案
　　實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)用免疫印跡法對(duì)所有大鼠血清進(jìn)行P.carinii抗體測(cè)定，以驗(yàn)證其之前沒(méi)有接觸過(guò)卡氏肺孢子菌。而后將雌性SD大鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾S機(jī)分成三組，10只/組。
　　模型誘導(dǎo)成功后對(duì)SD大鼠心臟采血分離血清，行支氣管肺泡灌洗，留支氣管肺泡灌洗液，取肺、脾，待進(jìn)一

8、步檢測(cè)。
　　2、大鼠體重、肺重/體重比的變化
　　實(shí)驗(yàn)前后均記錄各組大鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠取肺，吸干表面水分后稱全肺濕重。
　　3、肺孢子菌病原體及肺組織病理改變的觀察及肺孢子菌負(fù)荷
　　將大鼠左右四個(gè)右肺葉分別作橫斷面，制成肺印片，進(jìn)行六亞甲基四胺銀(GMS)染色、瑞姬染色觀察P.carinii包囊及滋養(yǎng)體，同時(shí)在GMS染色肺印片油鏡順序觀察計(jì)數(shù)P.carinii包囊數(shù)。取1cm3大小右肺下葉肺組織入10

9、％中性福爾馬林固定，常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，組織切片，HE染色觀察。
　　4、支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)
　　右肺單側(cè)結(jié)扎，用生理鹽水經(jīng)支氣管灌洗左肺，獲得支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心分離上清及沉淀，留取上清液1ml混勻，血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)BALF中的炎癥細(xì)胞總數(shù)。然后細(xì)胞制片機(jī)制備直徑約1cm的涂片，快速染色進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。
　　5、脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及亞群檢測(cè)
　　淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT

10、法）及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群。
　　6、ELISA法檢測(cè)大鼠血清細(xì)胞因子及IgG抗體
　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、白細(xì)胞介素-23(IL-23)以及IgG總抗體和亞類(lèi)水平。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┤斯ず铣纱?lián)

11、基因TAG原核表達(dá)產(chǎn)物GST-TAG重組蛋白免疫活性分析
　　1、斑點(diǎn)雜交檢測(cè)免疫抗體產(chǎn)生
　　結(jié)果表明TAG重組蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性抗體。免疫后血清組有明顯的棕色斑點(diǎn)，并在抗體滴度為1∶512，到1∶1024時(shí)斑點(diǎn)顏色開(kāi)始明顯減弱，說(shuō)明TAG重組蛋白具有良好的抗原性，并顯現(xiàn)出較高的敏感性。
　　2、多克隆抗體特異性的Western Blot鑒定
　　結(jié)果顯示GST-TAG重組蛋白樣品與免疫小鼠抗血清結(jié)

12、合呈現(xiàn)陽(yáng)性帶，處于69 kDa的位置，說(shuō)明免疫小鼠所制備的抗體適合用做后續(xù)P.carinii檢測(cè)和P.carinii結(jié)構(gòu)蛋白基因功能的研究。
　　3、免疫小鼠制備多克隆抗血清鑒定PCP小鼠和正常小鼠肺組織勻漿中的P.carinii
　　在PCP小鼠肺組織勻漿種有多條抗GST-TAG的血清抗體條帶，出現(xiàn)在50到120 kDa之間的范圍內(nèi)。主要集中在65到120 kDa范圍內(nèi)。
　　4、GST-TAG重組蛋白免疫反應(yīng)性的檢

13、測(cè)
　　誘導(dǎo)后的重組蛋白GST-TAG與PCP小鼠陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，在69kDa處出現(xiàn)了目的特異性條帶;而對(duì)應(yīng)未誘導(dǎo)產(chǎn)物及GST蛋白對(duì)照則未出現(xiàn)特異性條帶。
　?。ǘ┤斯ず铣纱?lián)基因TAG真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在真核細(xì)胞中表達(dá)
　　1、真核表達(dá)重組質(zhì)粒pIRES-hrGFP-1a-p55/TAG的鑒定
　　BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切真核表達(dá)載體pIRES-hrGFP-1a/TAG產(chǎn)生兩個(gè)片段，分別為5.0kb

14、、1.18kb，與預(yù)期結(jié)果相符。
　　2、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)表達(dá)
　　直接熒光顯微鏡觀察及Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明pIRES-hrGFP-1a/TAG重組質(zhì)粒可以在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。
　?。ㄈ﹑IRES-hrGFP-1a-p55/TAG重組質(zhì)粒作為DNA疫苗的免疫保護(hù)作用研究
　　應(yīng)用pIRES-hrGFP-1a-p55/TAG重組質(zhì)粒作為DNA疫苗，免疫組大鼠的體重、肺重/體重比及肺孢子

15、菌包囊計(jì)數(shù)均較PBS及pIRES-hrGFP-1a空載體組明顯減少。病理切片觀察發(fā)現(xiàn)PBS及pIRES-hrGFP-1a空載體組(HE染色)肺實(shí)變明顯，肺泡間質(zhì)水腫，血管充血擴(kuò)張，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，在GMS染色下可見(jiàn)肺泡壁及間質(zhì)中許多被染成棕黑色的P.carinii包囊，而pIRES-hrGFP-1a/TAG免疫組明顯減輕。與PBS及pIRES-hrGFP-1a空載體組相比，TAG免疫組的BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞絕對(duì)

16、值明顯降低;大鼠脾淋巴細(xì)胞顯著增殖，以及脾T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+T細(xì)胞與CD4+/CD8+比顯著增加;TAG免疫組血清中IgG總抗體及IgG2a亞類(lèi)水平顯著增高，細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17增高明顯;而各組大鼠血清IL-4、IL-23及IgG1水平無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1、獲得了純化的GST-TAG重組蛋白，具有良好的免疫原性及免疫反應(yīng)性;在P.carinii感染血清學(xué)診斷和抗原檢測(cè)中具有良好的敏感性和特異性。