卡氏肺胞子菌p55-v3 DNA疫苗的構(gòu)建及其對(duì)大鼠免疫保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:
　　 本研究擬采用分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的方法構(gòu)建卡氏肺孢子菌(Pneumocystis cannii,PC)p55-V3 DNA疫苗,同時(shí)將p55-v0抗原作為陽(yáng)性對(duì)照,免疫SD大鼠后,對(duì)p55-v3 DNA疫苗預(yù)防PC的作用進(jìn)行評(píng)定,并進(jìn)一步對(duì)其免疫作用機(jī)理進(jìn)行探討,為闡明PC與宿主相互作用的分子機(jī)制及新型疫苗的研制提供基礎(chǔ),進(jìn)而為PCP的防治提供一種新的方法和手段。
　　 方法:
　　 1.建立PC

2、P動(dòng)物模型并制備PC抗血清。
　　 2.提取PC感染鼠肺組織總RNA,運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增p55-v3和p55-v0抗原基因。
　　 3.運(yùn)用分子克隆的方法構(gòu)建p55-V3和p55-v0的真核表達(dá)載體。
　　 4.運(yùn)用脂質(zhì)體2000將鑒定正確的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR和Western-blot分別在mRNA及蛋白水平對(duì)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞兩種抗原蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):分別

3、將p55-v3、p55-v0 DNA疫苗免疫SD大鼠(以pVAX1空載體及PBS作為對(duì)照)后,按常規(guī)方法構(gòu)建PCP模型,于第6周處死大鼠,通過(guò)一般情況、肺重/體重、肺印片包囊計(jì)數(shù)、病理切片及體液免疫、細(xì)胞免疫的檢測(cè),觀察p55-v3和p55-v0 DNA疫苗對(duì)大鼠的免疫保護(hù)作用并進(jìn)行比較,從而對(duì)p55-v3的免疫保護(hù)機(jī)制及效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果:
　　 1.模型鼠肺印片(GMS染色),可見(jiàn)大量被染成棕黑色的PC包囊。

4、免疫組化證實(shí)血清中抗PC抗體陽(yáng)性。
　　 2.以總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR后,1％瓊脂糖凝膠電泳分析,在1200bp、1000bp左右處見(jiàn)一特異性條帶,分別與p55-v0、p55-v3抗原基因大小相符。
　　 3.將擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接,測(cè)序正確后構(gòu)建重組載體pVAX-p55-v0,pVAX-p55-v3。酶切鑒定表明p55-v3、p55-v0抗原基因片段己成功克隆入pVAX1載體。
　　 4.將重組真核表達(dá)

5、載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后提取總RNA,以其為模板進(jìn)行RT-PCR,1%瓊脂糖凝膠電泳觀察可見(jiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有明顯的特異性條帶,分別位于1200bp及1000bp左右,其大小與p55-v0及p55-v3基因片段一致,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組僅見(jiàn)內(nèi)參(GAPDH)條帶,未見(jiàn)特異性條帶;Westem-blot分析發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均可見(jiàn)約55 kDa大小的特異性條帶,提示在COS-7細(xì)胞中重組質(zhì)粒從mRNA及蛋白水平均有表達(dá)。
　　 5.構(gòu)建的

6、DNA疫苗免疫SD大鼠后發(fā)現(xiàn)pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫組肺重/體重、包囊計(jì)數(shù)較PBS及pVAX1空載體組明顯減少,而pVAX-p55-v0與pVAX-p55-v3免疫組之間無(wú)顯著性差異。病理切片觀察發(fā)現(xiàn)PBS及pVAX1空載體組(HE染色)肺泡間隔增寬,間質(zhì)水腫明顯,GMS染色下可見(jiàn)肺泡壁及間質(zhì)中大量被染成棕黑色的PC包囊,而pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫組明顯減輕,且pVAX-p55-v0與

7、pVAX-p55-v3之間無(wú)顯著性差異。與對(duì)照組相比,免疫組血清IgG顯著增高,脾淋巴細(xì)胞顯著增殖,血清IFN-γ,IL-2增高明顯,pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫組之間無(wú)明顯差異。各組大鼠血清IL-4水平無(wú)顯著性差異,
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建PCP模型并制備PC抗血清。
　　 2.成功擴(kuò)增p55-v0及p55-v3基因。
　　 3.成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pVAX-p55-