基因敲除鼠的建立及其表型的初步分析.pdf

1、線粒體通過氧化磷酸化（OXPHOS）生成ATP，為基本生命活動提供能量。線粒體嵴上承載著OXPHOS呼吸鏈復(fù)合物，嵴結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度與能量需求成正比，在能量需求高的組織，線粒體嵴也很豐富。線粒體內(nèi)膜的形態(tài)隨著代謝狀態(tài)不同而發(fā)生變化（Mannella，2006）。因此我們推測控制嵴形態(tài)的分子具有調(diào)節(jié)線粒體OXPHOS功能。Inner Membrane Protein of Mitochondria（IMMT），又稱Mitofilin，是定位

2、在線粒體內(nèi)膜上，控制嵴結(jié)構(gòu)的蛋白分子（John et al.，2005），為進(jìn)一步在整體動物水平探討IMMT生理功能，有必要建立Immt敲除鼠。
　　 我們通過囊胚注射，將Immt突變的胚胎干細(xì)胞（ES）注入到受體胚胎中，得到進(jìn)入種系的嵌合體而產(chǎn)生.Immt缺失雜合子（Immt+/-）。通過5’RACE和PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，基因誘捕載體整合至Immt基因的第三內(nèi)含子中，Immt+/-小鼠雜交后出生的346只子鼠中，沒有Immt缺失純

3、合子（Immt-/-），只有Immt+/+和Immt+/-小鼠，其比例為1:2，結(jié)合孟德爾規(guī)律推測，Immt完全缺失鼠未出生。
　　 我們分析了Immt+/-小鼠雜交后不同時(shí)間的胚胎，來研究Immt-/-小鼠是否存在胚胎致死及胚胎致死階段。結(jié)果證明，Immt-/-小鼠可以順利經(jīng)過囊胚階段并著床進(jìn)入原腸胚期。同窩.Immt+/-和Imm+/+小鼠已發(fā)育至9.5天胚胎（E9.5）形態(tài)，而Immt-/-小鼠還停留在E7.5天形態(tài)，明顯

4、的形體小，發(fā)育遲緩，Immt-/-小鼠沒有可見的心臟結(jié)構(gòu)和神經(jīng)管閉合。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)證明Immt-/-小鼠在E8.5天仍有增殖；TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明.Immt-/-胚胎細(xì)胞在E9.5天凋亡旺盛，逐漸吸收。
　　 透射電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示，E7.5、E8.5、E9.5 Immt-/-胚胎線粒體嵴紊亂，腫脹，部分空化缺失。Immt-/-胚胎酶組織化學(xué)和Immt+/-小鼠肝臟體外線粒體復(fù)合物酶活性檢測，共同證明IMMT缺失導(dǎo)致線粒體O

5、XPHOS電子傳遞鏈末端復(fù)合物，即細(xì)胞色素c氧化酶（COX）活性明顯降低，而琥珀酸脫氫酶（SDH）和ATP酶（ATPase）活性沒有觀察到明顯變化。Immt+/-MEF線粒體膜電位上升，活性氧（ROS）生成增多。所有這些改變都證明.Immt敲除鼠有明顯的OXPHOS異常。
　　 總之，Immt敲除鼠的建立，首次為闡明Immt在哺乳動物體內(nèi)功能提供了研究工具。我們通過對Immt敲除鼠的表型分析，在生物體內(nèi)證明，IMMT是生命中不可