sla-lp基因敲除鼠模型的建立;sla-lp啟動子的鑒定及其特點.pdf

1、[研究背景]自身免疫性肝炎(AIH)是三種自身免疫性肝臟疾病之一，在各種族、年齡段和性別均有發(fā)病，以女性和兒童多見。AIH病人對免疫抑制治療的反應非常好，但是，如果不及時治療，則預后比較差(Krawitt 1996)。因此，該病預后的關鍵是早期正確的診斷。然而，目前尚沒有一項理想的、特異性實驗室診斷指標。其診斷須結合血清學檢查(高IgG)、肝活檢、臨床表現及非特異性自身抗體(ANA、SMA、pANCA和LKM等)的存在進行綜合判斷。在所

2、有的AIH病人中，約20﹪的病人出現抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(抗-SLA/LP)抗體，這是目前唯一的一項具有100﹪特異性的實驗室指標(Wies et al.2000)。 可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)是一種可溶性細胞漿蛋白，分子量約50kDa，在體內各組織中包括胚胎中廣泛表達，但在肝、胰、腎、肺等酶代謝活躍的器官高表達，活化的T細胞也過量表達，推測其可能為一種或一組酶(Wies et al.2000)。另有研究指出，

3、SLA與UGA serine tRNA-protein complex有關，可能是硒代半胱氨酸代謝途徑的重要一員(Costa et al.2000)。SLA/LP的化學本質和生物學功能直到最近才被實驗證實。研究發(fā)現，SLA/LP蛋白是真核生物和古生菌中硒蛋白合成過程中的一個關鍵酶一磷酸絲氨酰-tRNA：硒代半胱氨酰-tRNA合成酶，催化磷酸絲氨酰-tRNA轉化為硒代半胱氨酰-tRNA，從而將用于蛋白質合成的第21種氨基酸～硒代半胱氨酸運

4、輸到核糖體，合成硒蛋白(Chambers et al.1986；Zinoni et al.1986；Yuan etal.2006；Xu et al.2007)。目前，對SLA/LP蛋白的表達調控知之甚少，尚未見相關文獻發(fā)表；同時對sLA/LP蛋白在AIH中的自身免疫作用機理也不清楚。因此，如果對sLA/LP了解的多一些，對明白SLA/LP的自身免疫性及AIH的發(fā)病機理都會有幫助。為此，本課題計劃建立sla/lp基因敲除鼠模型，并對sla

5、/lp基因的啟動子進行定位，尋找存在的轉錄因子，并確定其在SLA/LP蛋白表達中的調控作用。 第一部分：sla/lp基因敲除鼠模型的建立[研究目的] 創(chuàng)建sla/lp基因敲除鼠模型，研究其表型變化，進一步闡明SLA/LP功能，同時為SLA/LP功能及AIH的相關研究提供一個比較理想的動物模型。 [研究方法] (1)利用基因克隆技術，構建基因敲除載體。(2)將基因敲除載體電轉到胚胎干細胞(Rl ES)中，通過同源重組完

6、成基因序列的置換。(3)藥物篩選耐藥克隆，Southern Blot篩選陽性重組子克隆。(4)用顯微注射方法，將發(fā)生重組后的ES細胞注射到來自C57BL/6鼠的3.5天的囊胚中，并移植到代孕母鼠體內，以產生嵌合體小鼠。(5)將雄性嵌合體小鼠與野生型雌性C57BL/6小鼠交配，獲得雜合體小鼠。(6)將雜合體小鼠交配，獲得基因敲除純合體小鼠。(7)分析基因敲除鼠的表型變化。 [結果] 構建的基因敲除載體含有兩個同源序列，分別稱作5

7、’Arm和3’Arm。5，Arm長2007bp，含有從內含子2-3到外顯子3的序列；3’Ann長4256bp，含有從內含子6-7到外顯子8的序列。同源重組后，將敲掉自外顯子3到內含子6-7之間長約5867bp的一段序列。在5，Arm后，加入了EGFP基因；在兩個同源序列之間含有陽性選擇標記-新霉素基因；在兩個同源序列之外含有陰性選擇標記．單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，用于陽性重組胚胎干細胞克隆的藥物篩選。將構建的基因敲除載體

8、電轉到ES細胞中后，用G418和ganciclovir篩選耐藥克隆。在400多株耐藥克隆中，Southern Blot分析確定了3株陽性重組子克隆。 利用陽性ES細胞誕生了7只具有高度嵌合性的雄性嵌合體小鼠。因為ES細胞來自129/Sv小鼠，囊胚來自C57BL/6小鼠，故嵌合體小鼠毛色為黑色和棕色。將嵌合率高于80﹪的雄性嵌合體小鼠與野生型C57BL/6雌鼠雜交后，后代均為黑色，PCR檢測無新霉素基因的存在，未產生應該為棕色的

9、雜合體子代小鼠。 [結論] 基因敲除載體被成功構建，且可產生嵌合體小鼠，但是遺傳性狀無法傳遞給子代。需選擇其他陽性ES細胞克隆重復進行顯微注射，或者構建新的敲除載體，以克服遺傳性狀不能傳遞的缺陷。 [研究方法](1)利用基因克隆技術將一長1740bp的小鼠sla/lp基因片段克隆到熒光素酶報告載體一pGL3 basic vector。(2)將構建的質粒分別轉化到HEK293，RAW264.7和Hepa1-6這三種不同

10、的細胞系中進行熒光素酶實驗。(3)熒光素酶實驗證實該1740bp片段具有起始轉錄功能后，經系列5’端剪切和3’端剪切定位核心啟動子位置。(4)利用計算機軟件預測可能存在的轉錄因子結合位點，檢測對這些位點進行點突變后各克隆熒光素酶活性的變化，從而初步確定這些轉錄因子結合位點是否存在及其作用。(5)利用凝膠遷移實驗(EMSA)和超凝膠遷移實驗(Super shift)對轉錄因子結合位點加以確認。 [結果](1)1740bp小鼠sl

11、a/lp基因片段位于轉錄起始點上游并含蓋轉錄起始點(-1623～+117)。熒光素酶實驗證實其具有啟動子活性并且活性具有方向性，表達在三種細胞中無差異。(2)經過系列剪切后，具有起始轉錄功能的最短片段定位于-99～-37，一個長63bp片段內。(3)該63bp片段不存在典型的核心啟動子元件，如TATA盒，起始子(Inr)，下游啟動子元件(DPE)和TFIIB識別元件(BRE)。(4)CpGProD和Alibaba2.1軟件預測，sla/

12、lp基因啟動子很可能是CpG島型啟動子，并預測在63bp片段內存在兩個Spl結合位點(-85～-76和．55～-41)，一個RAPl結合位點(-71～-62)。在63bp片段上游存在一個Oct-1結合位點(-184～-175)。(5)63bp片段內的兩個Spl結合位點及RAPl結合位點分別經過點突變后，所產生的克隆幾乎完全喪失起始轉錄的功能；而Oct-1結合位點的點突變克隆則可以在不同的細胞系中提高轉錄能力2.8到6.3倍。(6)這4個

13、轉錄因子結合位點的凝膠遷移實驗均出現了滯后帶；其中，Spl(-85～-76)和Oct-1(-184～-176)的Super shift實驗出現超滯后帶，證實了這兩個位點的存在；而Spl(-55～-41)和RAPl(-71～-62)結合位點未出現超滯后帶，故尚不能確定它們一定存在。 [結論](1)sla/lp基因的啟動子為CpG島型啟動子，核心啟動子位于一個長63bp的片段內，位于轉錄起始點上游-99～-37的位置，不含有典型的

14、核心啟動子元件，內含一個轉錄活化因子spl、一個spl樣和一個可能的RAPl結合位點。其上游含有轉錄抑制因子Oct-1結合位點。(2)SLA/LP蛋白在體內正常的廣泛表達是轉錄活化因子Spl，RAPl和轉錄抑制因子Oct-1作用之間動態(tài)平衡的結果。(3)導致該平衡失衡的因素可能是AIH病人產生抗-SLA/LP抗體的基礎。 [總結]在建立sla/lp基因敲除鼠模型過程中，成功的構建了基因敲除載體，并順利地誕生了嵌合體小鼠，但改變

15、后的基因未能成功地傳遞給子代獲得雜合體小鼠，這里面含有許多經驗教訓，在今后的工作中，許多方面需要給予更多的關注。在ES細胞的培養(yǎng)過程中，要盡量避免或降低各種可能引起分化因素的作用，以最大程度提高遺傳性狀的可傳遞性。 Sla/lp基因的啟動子為CpG島型啟動子，核心啟動子位于一長63bp片段內，缺乏典型核心啟動子元件，如TATA box，Inr，DPE，BRE等；轉錄因子Spl是sla/lp基因的轉錄活化因子， Oct-1為轉錄

16、抑制因子，同時還可能存在轉錄活化因子RAPl的結合位點，為一多調節(jié)因子型啟動子，同時也提示了sla/lp基因表達調控的復雜性。SLA/LP蛋白在體內的正常表達應該是Spl/RAPl和Oct-1作用動態(tài)平衡的結果；引起該平衡失衡的因素可能是導致SLA/LP在AIH中產生自身免疫性的原因之一，因此，進一步尋找這些因素將會是非常有意義的工作。 目前找到的調控sla/lp表達的轉錄因子，無論是活化因子還是抑制因子，均是在體內廣泛表達的

17、、無組織特異性的因子，這從一個側面說明了為什么SLA/LP在體內各組織中廣泛表達，而不具有組織特異性。這些轉錄因子的濃度和活性可能是控制sLA/LP蛋白在各組織中表達量不同的因素之一。同時，這種表達特點也帶給我們這樣一個問題，即在體內廣泛表達的SLA/LP，為什么在AIH中只影響到肝臟，而不影響其他組織器官呢?是因為SLA/LP在AIH病人肝臟中的異常表達造成的嗎?但我們的另一個實驗結果顯示SLA/LP在AIH、其他肝臟疾病以及健康對照