兩株H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定及遺傳演化分析.pdf

1、豬流感（Swine influenza，SI），是由豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起的一種在豬群常發(fā)的急性、熱性、傳染性呼吸道疾病，其普遍存在于豬群中且根除困難。流感病毒具有較強的宿主選擇特異性，自然條件下禽流感病毒和人流感病毒不會發(fā)生基因重組，但研究表明兩者可以通過豬這一中間宿主來實現(xiàn)重組變異產(chǎn)生新毒株。其原因為:豬體細胞表面同時具有a-2，3半乳糖苷唾液酸受體和a-2，6半乳糖苷唾液酸受體，其中前

2、者對禽流感病毒有較強的親嗜性，后者對人流感病毒有較強的親和性，所以豬體可以同時感染人、禽、豬流感病毒，扮演著流感“混合器”的角色。采用血清學監(jiān)測方法對豬流感的流行與分布情況進行調(diào)查，對流行的豬流感病毒毒株進行分離鑒定與遺傳演化分析，具有重要的經(jīng)濟學價值和公共衛(wèi)生學意義。
　　山東位于黃河下游，東臨渤海、黃海，與朝鮮半島、日本列島隔海相望，且為候鳥遷徙途經(jīng)路段，候鳥的遷徙擴增了流感病毒的基因庫，加上山東是養(yǎng)豬大省，豬流感時有發(fā)生，對

3、山東省豬流感病毒進行分離鑒定及遺傳演化分析意義重大。本實驗以山東作為實驗地點，對2013-2014年間送檢的山東省各地區(qū)的豬血清樣本共計1049份，用H1亞型豬流感病毒ELISA抗體檢測試劑盒進行抗體檢測。檢測結果發(fā)現(xiàn):豬流感在春冬兩季抗體陽性率高，尤其是兩季度中的12月份和3月份，分別為66.63％、55.90％;山東省內(nèi)的魯南和魯西南地區(qū)，豬流感的抗體陽性檢出率相對較高，分別為56.8％、55.3％，在膠東地區(qū)的抗體陽性檢出率較低，

4、僅為9.6％。
　　在山東省各地采集豬鼻拭子接10日齡的SPF雞胚，分別在ZC、NJ兩地各分離到一株豬流感病毒毒株，命名為:A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)、A/Swine/N J/03/2014(H1N1)。參照NCBI中已發(fā)表序列設計引物，經(jīng)RT-PCR擴增8片段，膠回收產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)Trans5a感受態(tài)，挑選陽性質(zhì)粒進行單克隆測序，并對測序結果進行遺傳進化分析。兩株分離株HA均含有7

5、個糖基化位點，其中5個在HA1，2個在HA2;裂解位點均為QSR/GL，中間沒有多個堿性氨基酸的插入，為低致病性的豬流感。兩株分離株的HA、M、NA、NP基因與H1N1豬流感病毒的同源性最高，而NS、PA、PB1、PB2基因與H3N2豬流感病毒的同源性最高，推斷兩株分離株有可能是由H1N1豬流感病毒與H3N2豬流感病毒重組變異而來。
　　分離株A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)在雞胚上進行傳代，并對E20代的病毒測序

6、分析，與原代病毒進行比對，查看變異位點，推斷變異趨勢，篩選疫苗候選毒株。比對結果顯示:截止到E20代，分離株A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)在個別位點發(fā)生變異，HA、NP蛋白分別有3個和2個氨基酸變異位點。
　　實驗還針對分離到的A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)毒株制備了高免血清，采用HI試驗和ELISA檢測對抗體效價進行監(jiān)測，結果顯示抗體水平在第六周時達到高免血清滴度，若不及時收集抗體水平會有下降