河南省H1N2亞型豬流感病毒分離株基因組演化特征和生物學(xué)特性研究.pdf

1、豬流感(swineinfluenza，SI)是由豬流感病毒引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，其臨床特點(diǎn)為突發(fā)高熱，呼吸困難，體重下降和繼發(fā)感染等，直接影響豬只的生產(chǎn)性能和自身抵抗力，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬流感病毒在流感病毒的生態(tài)分布和遺傳進(jìn)化中占有重要地位，特別是對人類健康有著巨大的潛在威脅。而河南是中國的養(yǎng)豬大省，但目前關(guān)于河南省豬流感的分子流行病學(xué)以及豬流感病毒的免疫致病機(jī)制的研究報(bào)道較少，因此，對河南省乃至華北地區(qū)SIV病原

2、學(xué)、基因遺傳演化特征和免疫致病機(jī)制的研究不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，而且有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
　　 為了調(diào)查豬流感在河南省的流行情況，本試驗(yàn)在2010年9月-2011年3月從河南省商丘、漯河和新鄉(xiāng)等11地的豬場、屠宰場或豬病門診采集具有呼吸道癥狀的豬鼻拭子410份、病死豬肺臟63份。將病料無菌處理后接種于9-10日齡的雞胚尿囊腔，進(jìn)行病毒分離。結(jié)果表明分離到3株疑似豬流感病毒，經(jīng)過RT-PCR鑒定，證實(shí)所分離毒株均為H1N2亞型

3、豬流感病毒，分別命名為SWHN/01/10、SWHN/02/10和SWHN/03/10。在此基礎(chǔ)上，對所分離毒株進(jìn)行有限稀釋克隆純化，結(jié)果顯示3株分離毒株的血凝價(jià)在1:16-1:2048之間，相差較大，其原因是不同分離株在雞胚中的增殖能力不同。生物學(xué)特性研究顯示：除SWHN/03/10不能凝集豬和牛的紅細(xì)胞外，其余兩株毒株均能凝集雞、綿羊、豚鼠、兔、小鼠、豬和牛的紅細(xì)胞；熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示SWHN/01/10和SWHN/02/10屬于

4、熱穩(wěn)定型，SWHN/03/10屬于中等熱穩(wěn)定型；3株毒株均對乙醚、氯仿和酸敏感；SWHN/01/10對雞胚的致病力較強(qiáng)，其雞胚半數(shù)感染量(EID50)和雞胚半數(shù)致死量(ELD50)分別為10-7.16和10-6.54，其他2株毒株對雞胚的感染力和致病力均較弱，其EID50分別為10-5.86和10-3.83，ELD50分別為10-2.43和10-2.67。將3株病毒分別接種MDCK細(xì)胞，結(jié)果顯示3株病毒均能引起細(xì)胞產(chǎn)生明顯的病變；3株毒

5、株接種小鼠后，未觀察到明顯臨床癥狀，推測毒株對小鼠致病力較弱。
　　 為進(jìn)一步了解所分離的SIV毒株的遺傳演化特征，本研究對SWHN/01/10和SWHN/02/10毒株全基因組的8個(gè)片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆和核苷酸序列測定，對測定結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析后，從GenBank下載大量序列，采用phylip3.64和IMEGA4等軟件進(jìn)行遺傳演化分析。結(jié)果顯示毒株SWHN/01/10和ISWHN/02/10均為新型四源重組

6、豬流感病毒，其中HA和INP基因片段推測來源于經(jīng)典豬流感；NA和PB1基因推測來源于人H3N2流感病毒；PB2基因推測來源于美洲禽流感；M基因片段推測來源于歐亞禽流感；SWHN/01/10毒株NS基因來源于亞洲禽流感，而SWHN/02/10毒株NS基因來源于經(jīng)典豬流感。新型四源重組流感病毒的發(fā)現(xiàn)再次證明了”豬”是流感病毒的混合器，其是否會成為豬群的主要流行毒株，是否會對人類健康構(gòu)成潛在威脅，這兩點(diǎn)都需要引起我們的高度重視，并需要進(jìn)一步深

7、入研究。
　　 為了解細(xì)胞因子在豬流感病毒感染的免疫反應(yīng)中的作用，本部分試驗(yàn)利用SIV感染豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量方法對在不同時(shí)間點(diǎn)收獲的細(xì)胞中的IL-1β、6、8、13、17、12p35、12p40和18等炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，IL-1βmRNA的表達(dá)量在48h增加到最高；IL-6mRNA的表達(dá)量在感染后1h內(nèi)顯著增加；IL-8mRNA的表達(dá)量在12h時(shí)達(dá)到最大量；IL-1

8、2P35mRNA的表達(dá)量在72h迅速上升達(dá)到對照的56.1倍；IL-12P40mRNA的表達(dá)量1-2h表達(dá)量較高；IL-13在72h達(dá)到最大值，為對照的30.7倍；IL-17mRNA的表達(dá)量在72h達(dá)到最大值，為對照的4.9倍；IL-18mRNA的表達(dá)量在12h達(dá)到對照的1.9倍。本部分試驗(yàn)結(jié)果顯示豬流感病毒感染PBMC后能引起炎性細(xì)胞因子表達(dá)量顯著增加。
　　 綜上所述，本研究對河南省部分地區(qū)豬流感病毒進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，首