胸膜肺炎放線桿菌毒素IV基因的克隆表達(dá)及間接ApxIVA3-ELISA方法的初步建立.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP),是由胸膜肺炎放線桿菌(Acfinobacillus pieuropneumoniae,APP)引起的豬的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病,給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.大量研究工作證實(shí),APP產(chǎn)生的溶血外毒素是其最重要的毒力因子和主要的保護(hù)性抗原,而只有毒素四(ApxIv)是所有15個血清型都分泌的,因此對其進(jìn)行研究具有很重要的意義.

2、本試驗(yàn)旨在應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),對編碼ApxIV3'-端的ApxIVA部分基因片段在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),初步建立間接ApxIVA3-ELISA方法,為豬傳染性胸膜肺炎的新型診斷方法的建立奠定基礎(chǔ). 本試驗(yàn)以提取的豬胸膜肺炎放線桿菌血清8型菌株基因組DNA為模板,用PCR方法擴(kuò)增出ApxIVA3特異性基因片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與載體pMD18-T進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化,經(jīng)酶切及序列分析鑒定后,亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中,構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)

3、粒pET-ApxIVA3,序列分析結(jié)果表明:Hpn-405菌株與標(biāo)準(zhǔn)8型基因同源性達(dá)99.8﹪.將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-ApxIVA3轉(zhuǎn)入到大腸埃希氏菌BL21(DE3)中,以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示,表達(dá)的融合蛋白分子質(zhì)量約為18Ku,與預(yù)期片段大小相符;將經(jīng)過超聲破碎的菌液離心取沉淀經(jīng)尿素洗滌溶解后用鎳金屬螯合層析柱進(jìn)行純化.Western-blot分析證實(shí),該融合蛋白具有免疫學(xué)活性.在經(jīng)過變性、復(fù)