豬胸臘肺炎放線桿菌APXⅡ抗原表位表達(dá)及間接ELISA方法建立與應(yīng)用.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種以出血壞死性肺炎和纖維素性胸膜炎為特征的呼吸道傳染病，是危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。迄今，APP共有15個(gè)血清型。Apx毒素是APP主要的毒力因子和免疫原，15種血清型共產(chǎn)生四種毒素：ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ。Apx毒素分泌需要操縱子C、A、B、D4種基因的共同作用，A基因是毒素的結(jié)構(gòu)基因。除了血清10型，其余血清型均產(chǎn)生ApxⅡ。以ApxⅡ蛋白為基礎(chǔ)建立ELI

2、SA方法可作為一種跨越血清型障礙的檢測(cè)方法，對(duì)除10型外所有血清型作出檢測(cè)。本研究利用基因工程的方法表達(dá)ApxⅡA蛋白的主要抗原表位區(qū)，并基于此建立檢測(cè)豬血清中APP抗體的間接ELISA方法，為疾病診斷和疫苗免疫效果評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ主要抗原表位區(qū)原核表達(dá)和優(yōu)化
　　將豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅡ主要抗原表位區(qū)基因片段克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pE

3、T-ApxⅡA1。將重組質(zhì)粒pET-ApxⅡA1轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，外源基因獲得高效表達(dá)。最佳誘導(dǎo)條件為加入終濃度為1mmol/mL的IPTG37℃誘導(dǎo)5h，融合蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。通過(guò)Western-blot分析重組蛋白可被兔抗APP陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。
　　2、基于ApxⅡ主要抗原表位區(qū)的間接ELISA方法建立
　　將豬胸膜肺炎放線桿菌Apx

4、Ⅱ主要抗原表位重組蛋白作為包被抗原，包被酶標(biāo)板，建立了檢測(cè)豬APP血清抗體的間接ELISA方法。通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，初步確定了間接ELISA方法的最佳反應(yīng)條件：其抗原的包被濃度為1.23μg/mL；血清稀釋度為1：100；4℃包被過(guò)夜；1％BSA37℃封閉1h；一抗反應(yīng)時(shí)間為60min；酶標(biāo)二抗工作濃度為1：10000；最佳底物顯色時(shí)間為4min。確定了間接ELISA方法的臨界值，對(duì)其特異性和重復(fù)性進(jìn)行了檢測(cè)，并與商品化ApxⅣ抗體檢測(cè)

5、試劑盒分別對(duì)94份臨床非免疫血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩者的符合率為90.4%，表明所建立的間接 ELISA方法具有良好的特異性、重復(fù)性。
　　3、江蘇安徽兩省部分豬場(chǎng)豬胸膜肺炎放線桿菌流行病學(xué)調(diào)查
　　用建立的間接ELISA方法對(duì)江蘇安徽兩省部分豬場(chǎng)2013年采集送檢的未免疫豬胸膜肺炎放線桿菌的血清共計(jì)552份檢測(cè)APP抗體，檢出230份，總陽(yáng)性率為41.67%。江蘇送檢的12個(gè)豬場(chǎng)共460份血清，血清總陽(yáng)性率為40.65%；安徽

6、送檢的5個(gè)豬場(chǎng)共92份血清，血清總陽(yáng)性率為46.74%。其中種豬血清總計(jì)106份，血清總陽(yáng)性率為64.15%；南通、徐州兩地豬場(chǎng)共送檢血清98份，妊娠母豬、育肥豬、保育豬、哺乳豬的血清陽(yáng)性率分別為100%、25%、14.29%、84.21%。兩省的大部分豬場(chǎng)均存在豬胸膜肺炎放線桿菌感染情況，不同生長(zhǎng)階段的豬群均可感染APP。
　　綜上所述，本試驗(yàn)成功原核表達(dá)獲得豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ主要抗原表位區(qū)基因片段編碼的蛋白，建立了檢測(cè)