RISC相互作用蛋白的確定及功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：用酵母雙雜交技術(shù)研究與RISC相關(guān)的蛋白并確定其功能。 方法：以能表達(dá)人類真核翻譯起始因子AGO2的pSos質(zhì)粒作為誘餌，采用CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)，選用人類肺組織的cDNA文庫，篩選與誘餌相互作用的蛋白，并在酵母中驗(yàn)證蛋白－蛋白相互作用的特異性。將篩選出來的相互作用蛋白和誘餌蛋白在真核HEK293細(xì)胞中共同表達(dá)，用免疫共沉淀和Western blot技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證二者的相互作用。在體內(nèi)，將表達(dá)篩選所得蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)

2、入人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U373中已經(jīng)構(gòu)建好的RNA干擾體系中，觀察這些蛋白對(duì)RNA干擾中RISC活性的影響。 結(jié)果：經(jīng)過CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選，共得到22個(gè)可能的陽性相互作用子。在酵母中驗(yàn)證蛋白-蛋白相互作用的特異性后，得到7種不同的陽性質(zhì)粒。 用免疫共沉淀和Western blot技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證二者的相互作用，最后得到4種相互作用的蛋白，分別為人類蛋白酶體26S ATP酶亞基3；人類DNA斷裂因子，45kDa，

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