爪哇猴由環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引致性早熟疾病模型的建立及中藥作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:(1)建立靈長(zhǎng)類—爪哇猴由環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrinedisruptors，EEDs)引致的性早熟疾病模型。(2)在爪哇猴性早熟模型上驗(yàn)證滋陰瀉火中藥對(duì)EEDs擬雌激素活性的拮抗作用，以更準(zhǔn)確地模擬人類的疾病過(guò)程及藥物的治療作用。(3)采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，研究并闡明中藥拮抗EEDs擬雌激素活性的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的有效拮抗EEDs生殖毒性的中藥制劑提供更為恰當(dāng)?shù)睦碚撘罁?jù)。

2、>　　方法:(1)預(yù)實(shí)驗(yàn):以青春前期雌性爪哇猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選取具有代表性的EEDs—壬基酚(4-nonylphenol，4-NP)及雙酚A(bisphenol A，BPA)作為染毒物質(zhì)，復(fù)制爪哇猴性早熟的疾病模型。爪哇猴分為兩個(gè)月齡組，每個(gè)年齡組分高劑量染毒組、低劑量染毒組及對(duì)照組。每日空腹給藥。以陰道脫落細(xì)胞成熟指數(shù)、子宮容積、子宮濕重、臟器系數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、子宮肌層厚度、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮腺上皮高度為指標(biāo)。結(jié)果采用單因素方

3、差分析，觀察EEDs的擬雌激素作用。確定爪哇猴性早熟疾病模型建立的最佳月齡、最佳染毒劑量及最佳染毒時(shí)間。(2)以最佳月齡的青春前期雌性爪哇猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以最佳劑量的壬基酚(nonylphenol，4-NP)及雙酚A(bisphenol A，BPA)復(fù)制聯(lián)合染毒的性早熟疾病模型。爪哇猴隨機(jī)分為染毒組，治療組及對(duì)照組，每日空腹給藥。染毒組喂飼4-NP及BPA，治療組喂飼4-NP、BPA及中藥，對(duì)照組喂飼溶劑玉米油。以雌激素水平、陰道脫落細(xì)胞

4、成熟指數(shù)、子宮濕重、臟器系數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、子宮肌層厚度、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮腺上皮高度為指標(biāo)，結(jié)果采用單因素方差分析，驗(yàn)證中藥對(duì)EEDs擬雌激素活性的拮抗作用。(3)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及免疫印跡方法（Western Blotting）方法，檢測(cè)雌激素受體α（estrogen receptorα，ERα）、雌激素受體β（estrogen receptorβ，ERβ）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal

5、 growth factor receptor，EGFR）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cytochrome P450，family11，subfamily A,polypeptide1，CYP11A1）、芳香化酶（cytochrome P450，family19，subfamily A，polypeptide1，CYP19A1）基

6、因及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果采用單因素方差分析。通過(guò)染毒組、治療組及對(duì)照組的相互對(duì)比，闡明中藥拮抗EEDs擬雌激素活性的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)確定爪哇猴由EEDs引致性早熟疾病模型，應(yīng)以26月齡為最佳月齡，以低劑量BPA（200mg/kg）及4-NP(50mg/kg)為最佳染毒劑量，以4周為最佳染毒時(shí)間。(2)染毒組與對(duì)照組比較雌激素水平明顯升高，陰道脫落細(xì)胞成熟指數(shù)顯著增加，子宮濕重、臟器系數(shù)、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮腺上皮高

7、度顯著增加，子宮內(nèi)膜及肌層厚度明顯增高。治療組與染毒組相比，上述指標(biāo)均顯著降低(p＜0.05)。(3) RT-PCR方法檢測(cè)顯示BPA、4-NP聯(lián)合染毒可導(dǎo)致ERα、ERβ、EGFR、IGF-1R、CYP11A1、CYP19A1的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(p＜0.05)。而中藥干預(yù)后，可使上述基因表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.05)。(4)經(jīng)Western Blot方法驗(yàn)證BPA、4-NP聯(lián)合染毒可導(dǎo)致ERα、ERβ、EGFR、CYP19A1的