問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體LA0202基因的鑒定與功能研究.pdf

1、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株＃56601(強(qiáng)毒株)的全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成。在基因詮釋的基礎(chǔ)上, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼鑒定出在問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體賴株染色體上有眾多溶血素編碼基因，并認(rèn)為溶血素可能和鉤端螺旋體致病相關(guān)。LA0202基因是位于問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體賴株大染色體上類噬菌體片段上的一個(gè)基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及二級(jí)結(jié)構(gòu)和大腸埃希菌K12株成孔蛋白類溶血素E（ Hemolysin E)及化膿性鏈球菌MGAS315株中

2、推測(cè)的孔形成多肽具有一定的相似性，推測(cè)其可能又是一個(gè)和鉤端螺旋體致病相關(guān)的溶血素基因。因此，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)LA0202基因進(jìn)行鑒定，并對(duì)其功能性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 首先將LA0202基因克隆到pET28b(+)原核表達(dá)載體中并成功在體外表達(dá)純化了該蛋白。 RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)證明LA0202基因在問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體賴株中可以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。然后對(duì)此表達(dá)的蛋白進(jìn)行了體外溶血活性、溶

3、血機(jī)制及細(xì)胞毒性等一系列實(shí)驗(yàn)研究。 結(jié)果如下：（1）溶血活性實(shí)驗(yàn)顯示：LA0202 蛋白具有溶血活性：通過(guò)血平板熱-冷孵育法觀察到清晰的β-溶血環(huán)；通過(guò)透射電鏡觀察法看到溶血素作用后的綿羊紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染色不均一，細(xì)胞內(nèi)部有空泡出現(xiàn)，細(xì)胞膜不完整，局部已出現(xiàn)破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物開(kāi)始外泄。（2）溶血機(jī)制研究表明：不同濃度的滲透壓保護(hù)劑PEG加入后對(duì)溶血素LA0202的溶血活性均有明顯抑制作用；經(jīng)加熱處理后溶血素LA0202的溶血活性

4、完全喪失；金屬陽(yáng)離子Mg2+﹑Mn2+﹑Ca2+，蛋白酶抑制劑EDTA和PMSF對(duì)溶血素的溶血活性影響不大，因此初步推測(cè)LA0202為成孔蛋白類溶血素。（3）細(xì)胞毒性研究表明：LA0202蛋白對(duì)肝細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用，通過(guò)倒置顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，溶血素LA0202作用正常人肝細(xì)胞L-02后呈現(xiàn)出顯著細(xì)胞毒性，肝細(xì)胞不僅顯現(xiàn)細(xì)胞壞死特征而且還同時(shí)顯現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征，并且肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例隨著溶血素作用