單增李斯特菌LM90侵染人-鼠腦微血管內(nèi)皮細胞cDNA文庫構(gòu)建.pdf

1、單核細胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes, LM)是重要的食源性胞內(nèi)致病菌,臨床主要引起腦膜炎,腦膜腦炎,圍產(chǎn)期母畜和胎兒感染。該病的發(fā)生主要是源于該菌能穿過動物三大屏障:腸道屏障、血腦屏障、血胎屏障。LM可以跨越血腦屏障中主要組成結(jié)構(gòu)—腦微血管內(nèi)皮細胞間緊密連接,表明LM表面存在著不同的配體,這些配體可以與內(nèi)皮細胞上受體相結(jié)合,進而使其進入宿主細胞內(nèi)與細胞內(nèi)的蛋白相互作用。為了篩選與LM表面蛋白相互作用的宿

2、主內(nèi)皮細胞蛋白,本研究以人腦微血管內(nèi)皮細胞(原代)、鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(傳代)為體外血腦屏障模型,通過LM侵染上述細胞建立cDNA文庫,為酵母雙雜交的篩選奠定基礎(chǔ)。
　　1.李斯特菌的PCR檢測:根據(jù)已公布李斯特菌各菌種保守基因Iap和lmo0038的核苷酸序列,合成了能夠區(qū)分李斯特菌不同種的特異性引物,對實驗室保存的菌種進行PCR的驗證,本試驗中李斯特菌各菌株的PCR鑒定結(jié)果為:種1、種2、種3擴增出1108bp特異性條帶,確定

3、為塞氏李斯特菌,種5、干粉3、干粉4擴增出720bp和403bp特異性條帶,確定單核細胞增多性李斯特菌。
　　2.LM對人/鼠腦微血管內(nèi)皮細胞黏附、侵襲及胞內(nèi)增殖試驗:用單增李斯特菌LM90、LM3(干粉3)、LM4(干粉4),塞氏李斯特菌(LS,種2),無害李斯特菌(ATCC33090)感染腦微血管內(nèi)皮細胞,采用BHI平板計數(shù),測定細菌黏附率、侵襲率及不同時間細胞內(nèi)增殖情況。試驗結(jié)果表明:LM90、LM3、LM4對腦微血管內(nèi)皮細

4、胞黏附率3.04％~7.83%,統(tǒng)計學(xué)分析差異不顯著;LM90、LM3、LM4、對人/鼠腦微血管內(nèi)皮細胞侵襲率(0.036%~0.128%)均大于L.seeligeri(0.0315%、0.00148%),L.innocua則不侵襲腦微血管內(nèi)皮細胞。LM90、LM3、LM4對人/鼠兩種細胞的侵襲率存在顯著差異(P<0.05),同一細菌在不同腦血管內(nèi)皮細胞中出現(xiàn)最高菌量及時間有差異,臨床分離株LM90增殖速度及菌量明顯高于其它菌株。LM不

5、同菌株粘附和侵襲不同腦微血管內(nèi)皮細胞以及在其中增殖的速率存在差異。
　　3.LM90侵染腦微血管內(nèi)皮細胞cDNA文庫構(gòu)建:用單增李斯特菌LM90株以100:l(細菌:細胞)的個數(shù)比,侵染人/鼠腦微血管內(nèi)皮細胞0.5h、1h、2h、3h、4h后提取RNA,通過RT-PCR擴增mRNA,PCR產(chǎn)物與捕獲載體經(jīng)過sfiI酶切后連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,構(gòu)建LM侵染的人/鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的cDNA文庫,并對文庫中的部分克隆進行測序。試驗結(jié)果表

6、明,構(gòu)建的LM90侵染鼠腦微血管內(nèi)皮細胞cDNA文庫中,共獲得1.2×105個轉(zhuǎn)化子,陽性重組率為97.92%,1kb-2kb之間片段約占22.9%,0.5kb-1kb之間片段約占70.83%,0.5kb以上片段約占93.75%,測序基因功能涉及鈣離子結(jié)合、受體信號激活等;構(gòu)建的LM90侵染人腦微血管內(nèi)皮細胞 cDNA文庫中,共獲得1.03×105個轉(zhuǎn)化子,陽性重組率為87.5%,1kb-1.5kb之間片段約占7.14%,0.5kb-1