單精注射制備轉(zhuǎn)基因豬胚胎技術(shù)的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究開始于上個(gè)世紀(jì)七十年代末，是一項(xiàng)能對家畜基因組進(jìn)行修飾的有效技術(shù)，對改進(jìn)畜牧業(yè)生產(chǎn)效率有重大的作用。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)有原核注射法、精子介導(dǎo)法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法和體細(xì)胞移植法等。將精子載體轉(zhuǎn)基因法(SMGT)與單精注射(ICSI)結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一種新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究歷史較短，但其可行性和高效性已在多個(gè)物種得到試驗(yàn)證實(shí)。BAC作為轉(zhuǎn)基因載體，可攜帶的基因包括上下游調(diào)控序列，可以和轉(zhuǎn)錄酶、轉(zhuǎn)錄因子等作用，轉(zhuǎn)基因?qū)⒛茏袷鼗?/p>

2、固有的表達(dá)機(jī)制。所以將ICSI-SMGT技術(shù)與BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因豬，為我們今后制備大片段轉(zhuǎn)基因豬提供了新方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。為成功制備轉(zhuǎn)基因豬胚胎，本課題將從豬卵母細(xì)胞延遲保存與體外培養(yǎng)和以單精注射技術(shù)與BAC載體技術(shù)相結(jié)合為目標(biāo)的兩個(gè)方面進(jìn)行研究。
　　第一方面，建立豬卵母細(xì)胞體外延遲保存體系，擬設(shè)計(jì)先將卵母細(xì)胞分別放入TCM199（含HEPE）、PBS緩沖液（無Ca2+和Mg2+）和DMEM低糖培養(yǎng)基中37

3、℃保存6-8h后轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)液與瞬時(shí)放入成熟培養(yǎng)液的對照組作比較，統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)組之間成熟率，卵裂率和囊胚率的差別。其中對照組成熟率為78.19％，卵裂率為55.87％和囊胚率尾12.23％; TCM199試驗(yàn)組成熟率為76.25％，卵裂率為55.00％和囊胚率為12.12％; PBS試驗(yàn)組成熟率為49.00％，卵裂率為22.00％和囊胚率為2.27％; DMEM試驗(yàn)組成熟率為47.50％，卵裂率為20.50％和囊胚率為2.43％。比較結(jié)

4、果發(fā)現(xiàn)TCM199試驗(yàn)組與對照組無顯著差異，進(jìn)而將TCM199試驗(yàn)組的胚胎進(jìn)行胚胎移植，母豬受孕后產(chǎn)下11頭小豬，小豬健康狀況良好，體貌特征與自然受孕分娩的小豬無差異，所以TCM199（含HEPE）可以作為豬卵母細(xì)胞體外延遲保存液。為完善體外延遲保存體系，確立更好的延遲保存條件，設(shè)計(jì)將卵母細(xì)胞放入TCM199（含HEPE）后分別在4℃、25℃和37℃中保存6-8h后轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)液，統(tǒng)計(jì)分析各試驗(yàn)組之間成熟率，卵裂率和囊胚率的差別。其中4

5、℃試驗(yàn)組成熟率為19.00％，卵裂率為9.5％和無囊胚;25℃試驗(yàn)組成熟率為33.00％，卵裂率為15.00％和無囊胚;37℃試驗(yàn)組成熟率為76.50％，卵裂率為54.50％和囊胚率為13.76％。比較結(jié)果得出37℃為理想的體外延遲保存溫度。這一研究為實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞發(fā)育初始時(shí)間的可控性提高可能。
　　第二方面，為實(shí)現(xiàn)單精注射技術(shù)與BAC載體技術(shù)相結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因豬胚胎的目標(biāo)。需要利用ICSI技術(shù)成功制備出豬胚胎。首先將精子以工作3s，