鼻咽癌染色體12p12-11區(qū)段擴增基因的篩選及其功能研究.pdf

1、12p12-11擴增基因的篩選
　　 染色體擴增常導致瘤基因拷貝數(shù)增加和過表達,通過檢測腫瘤組織中染色體擴增區(qū)域內候選瘤基因的過表達已經成為尋找特定腫瘤相關瘤基因的重要途徑。染色體12p12-11長度為19Mb,包含123個已知基因和表達序列標簽。已有研究表明,+12p是大腸癌的早期事件,可能是生殖細胞腫瘤的晚期事件以及卵巢癌的中晚期事件。利用MEDLINE文獻數(shù)據(jù)庫及本實驗室已完成的鼻咽癌cDNA微陣列數(shù)據(jù)資料,我們從12p1

2、2-11區(qū)初步確定了18個鼻咽癌相關候選瘤基因,其中已明確的瘤基因及候選瘤基因有6個,另外12個基因與細胞轉化和增殖相關。采用RT-PCR和定量RT-PCR方法檢測鼻咽癌和慢性鼻咽炎組織中這18個基因的表達水平,結果顯示:其中9個基因在慢性鼻咽炎與鼻咽癌組織中均無表達;5個基因表達水平在36例鼻咽癌及8例慢性鼻咽炎組織之間無顯著差異;而有4個基因,提示其可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展相關。其中KCNJ8為ATP-敏感鉀離子通道基因的一個亞類,與

3、細胞的分泌和肌肉收縮有關,而與腫瘤發(fā)生及細胞的生長、增殖相關報道較少;PTX1主要參與內質網與高爾基體之間物質的膜運輸,僅發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌中表達下調;KRAS2在鼻咽癌中的研究頗多,其表達明顯高于慢性鼻咽炎;而BCAT1基因編碼支鏈氨基轉移酶,在Burkitt's淋巴瘤、乳腺癌組織中明顯上調,與細胞的增殖和凋亡有關,在鼻咽癌中尚未有相關報道。
　　 BCAT1基因在鼻咽癌不同病理階段中的表達
　　 從12p12-11篩選

4、出的相關瘤基因回到癌前病變各階段去考察能認識這些基因在鼻咽癌發(fā)病過程中的真正地位和意義,因此我們采用了免疫組化分析BCAT1蛋白在鼻咽正常上皮、增生活躍、輕中度、重度增生和鼻咽癌組織中的表達。結果表明,在正常假復層纖毛柱狀上皮、復層鱗狀上皮、輕中度增生、重度增生和鼻咽癌組織中均能檢測到BCAT1蛋白不同程度的陽性表達,陽性信號定位于細胞胞漿中;BCAT1蛋白在正常上皮、輕中度增生、重度增生和鼻咽癌組織中陽性表達率分別為23.6％、75％

5、、88.9％和88.75;結果提示在鼻咽部出現(xiàn)輕度增生早期病理改變時,BCAT1的表達就明顯增高,這說明BCAT1基因對于鼻咽癌的發(fā)生可能起重要作用,這也為進一步分析該基因表達異常的分子機制提供了依據(jù)。
　　 探討B(tài)CAT1基因在鼻咽癌中異常表達的可能機制
　　 探討瘤基因表達上調的機制主要從遺傳學改變和基因轉錄調控兩方面進行。首先,通過PCR結合測序的方法分析20例鼻咽癌中BCAT1的11個外顯子突變情況,共檢測出1個

6、外顯子區(qū)SNP位點,提示基因突變對BCAT的表達無明顯影響。其次,拷貝數(shù)增加被認為是瘤基因異常激活的一個重要機制,分析基因內部及其附近微衛(wèi)星位點的擴增可以間接反映基因組中基因的擴增情況。采用Real-timePCR分析了BCAT1基因內部D12S1435、D12S1617和RH44650三個微衛(wèi)星位點在鼻咽癌組織中擴增情況。
　　 真核基因的轉錄調控是一個非常復雜的過程,而轉錄因子參與的基因轉錄調控起重要作用。生物信息學分析顯示

7、在BCAT15'端非翻譯區(qū)-155/-200bp區(qū)域包含有c-Myc結合位點。為了揭示c-Myc是否對BCAT1的表達具有直接調控作用,我們進行了染色質免疫沉淀實驗。結果證實,c-Myc轉錄因子可以直接結合于BCAT1基因啟動子區(qū)的c-Myc結合位點。RT-PCR與免疫組化表明鼻咽癌中BCAT1和c-Myc的mRNA和蛋白的表達均上調,進一步利用RNA干擾技術建立了穩(wěn)定干擾c-Myc表達的5-8F鼻咽癌細胞系,結果發(fā)現(xiàn),封閉內源性c-M

8、yc的表達可以下調BCAT1基因mRNA的表達水平。另外,我們將帶有包含c-Myc結合位點的BCAT1調控序列與熒光素酶報告基因連接構建重組報告基因載體,分別轉染5-8F細胞、轉染空白載體的5-8F細胞以及5-8F/si-c-myc細胞中,經報告基因活性分析發(fā)現(xiàn),封閉內源性c-Myc表達后,與對照組相比,重組報告基因的熒光素酶活性降低。而在轉染c-Myc基因的COS7細胞系中具有較強的熒光素酶活性。
　　 利用RNA干擾技術研究

9、BCAT1基因在5-8F細胞的作用
　　 采用pSUPER.retro逆病毒載體系統(tǒng),構建了針對BCAT1的RNAi載體。經測序結果證實后,利用脂質體轉染技術將shBCAT1導入5-8F細胞,嘌呤霉素篩選獲得抗性克隆,PCR證實抗性克隆中含有shBCAT1;RT-PCR結果表明,shBCAT1表達載體能特異性導致BCAT1mRNA的表達下調了90％;Western:Blotting分析表明細胞中的BCAT1蛋白表達下調了55％左

10、右,這些說明我們已成功地建立了穩(wěn)定干擾BCAT1基因的5-8F細胞系。
　　 隨后,我們進一步考察了BCAT1被干擾后對5-8F細胞生物學特性的影響。流式細胞儀分析結果表明:轉染了shBCAT1的5-8F細胞阻滯于G1期,G1期細胞比例增加～16.66％,G2期細胞則減少了～6.91％,而對照組5-8F細胞與轉染空白質粒的5-8F細胞之間的細胞周期分布沒有明顯差異。MTT法檢測發(fā)現(xiàn),5-8F-shBCAT1細胞增殖速度明顯低于對

11、照組5-8F細胞與5-8F-blankvector細胞,統(tǒng)計學分析差異有顯著性。平板克隆形成實驗結果顯示5-8F-shBCAT1細胞的克隆形成率明顯低于轉染載體組。另外,遷移實驗和侵襲實驗證實,5-8F-shBCAT1細胞運動能力和侵襲能力明顯降低。
　　 BCAT1與LARS2在鼻咽癌中的相互作用及LARS2在鼻咽癌中下調機制的研究
　　 生物信息學是后基因組時代的利器。STRING是目前已知的、揭示已知和預測蛋白-蛋

12、白之間相互作用的、較廣泛使用的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫揭示的蛋白-蛋白相互作用既包括直接相互作用也包括間接關聯(lián)作用,其中數(shù)據(jù)來源于基因組背景分析、高通量實驗、共表達實驗和已公布的數(shù)據(jù)庫。同時,利用STRING還可以比較不同物種間的數(shù)據(jù)。最新版STRING8.1收錄了630個物種、超過2,590,259種蛋白質數(shù)據(jù)。
　　 在STRING的界面,輸入BCAT1,可以找到直接和間接相關蛋白分子10個,它們分別是LRMP、hCG26005、E

13、NSP00000372、BCKDHA、BCKDHB、IARS2、IARS、LARS2、LARS和BCAT1。從這些基因的染色體定位數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)LARS2基因位于鼻咽癌患者高頻丟失區(qū)3p21。
　　 LARS2基因編碼亮氨酰-tRNA合成酶。為了探討LARS2基因在鼻咽癌中的可能作用,我們首先采用了RT-PCR、Real-time PCR方法檢測LARS2在8例慢性鼻咽炎組織、36例鼻咽癌組織中的表達。結果發(fā)現(xiàn),LARS2在7

14、8％鼻咽癌組織中存在表達下調或缺失,提示LARS2可能是鼻咽癌相關候選抑瘤基因。接著,我們從遺傳學和表觀遺傳學改變兩方面探討了LARS2基因失活的主要機制。1.通過PCR-SSCP并結合測序方法分析了25例鼻咽癌中啟動子區(qū)和外顯子1突變情況,結果未檢測出突變和SNP,提示基因突變對于LARS2表達失活無明顯影響。2.由于基因內部及其附近微衛(wèi)星位點的丟失可以間接反映基因組中基因的缺失情況,我們采用了PCR-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染方法

15、分析LARS2基因內部的RH25266和SHGC-12886二個微衛(wèi)星位點在鼻咽癌組織中的丟失情況。結果表明,至少有28％的鼻咽癌組織中存在LARS2基因微衛(wèi)星位點的丟失,提示微衛(wèi)星位點的LOH可能對LARS2在鼻咽癌細胞中表達下調起一定的作用。3.鑒于啟動子區(qū)DNA異常甲基化是抑瘤基因在表觀遺傳學改變最為常見的方式,我們首先通過生物信息學軟件對LARS2啟動子區(qū)CpG島分布情況進行了分析,發(fā)現(xiàn)LARS2啟動子區(qū)存在一個227bp長的C

16、pG島。以此區(qū)域為模板,選擇針對該區(qū)段的甲基化和非甲基化特異性引物,利用甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR,MSPCR)技術,我們分析了慢性鼻咽炎和鼻咽癌組織中LARS2啟動子甲基化情況。結果發(fā)現(xiàn),64％鼻咽癌組織和12.5％慢性鼻咽炎組織存在LARS2基因啟動子甲基化情況,但鼻咽癌組織中LARS2基因甲基化比率明顯高于慢性鼻咽炎組織,兩者存在明顯的統(tǒng)計學差異,這提示啟動子甲基化是導致LARS2基因表達下

17、調的主要因素。
　　 綜上所述,通過本研究,我們首次從鼻咽癌發(fā)生早期事件+12p12-11區(qū)域內發(fā)現(xiàn)鼻咽癌相關瘤基因BCAT1,并系統(tǒng)、全面地考察了BCAT1蛋白在慢性鼻咽炎、鼻咽癌及鼻咽癌變不同階段組織中的表達情況,探討了導致其表達上調的可能機制,并進一步研究了BCAT1基因在鼻咽癌細胞中的功能。結果提示,BCAT1在慢性鼻咽上皮組織和正常鼻咽上皮中正常表達,而在鼻咽癌組織和鼻咽癌變不同階段明顯表達上調,而這種表達上調主要是由

18、于基因擴增所致,而瘤基因c-Myc對其直接調控也發(fā)揮了一定作用。RNA干擾實驗表明,干擾BCAT1的表達能夠抑制鼻咽癌細胞的增殖,導致細胞周期的阻滯。此外,我們通過生物信息學發(fā)現(xiàn)了與BCAT1蛋白有間接相互作用的LARS2蛋白。LARS2基因在鼻咽癌組織中表達明顯下調,其失活機制主要是基因啟動子區(qū)甲基化。鼻咽癌中BCAT1顯著上調和LARS2表達下調,共同導致了中間產物L-亮氨酸的累積,而L-亮氨酸則可以通過激活mTOR的信號傳導通路最